精通细菌培养物保藏：全球指南

细菌培养物是无数研究和工业应用的基石，从开发新抗生素到理解基本生物过程。正确保藏这些培养物对于确保结果可靠、防止污染以及为未来使用保存宝贵菌株至关重要。本综合指南为全球研究人员和专业人士详细概述了细菌培养物保藏的最佳实践。

为何培养物保藏如此重要？

有效的培养物保藏不仅仅是让细菌存活。它包括保持菌株的所需特性，确保其纯度，并防止遗传突变的累积。保藏不当的培养物可能导致：

• 实验结果不准确：培养物的遗传构成变化或污染会扭曲实验结果。
• 丢失宝贵菌株：忽视保藏可能导致重要细菌菌种的死亡或不可逆的改变。
• 成本增加：污染需要重新订购菌株和重复实验，导致巨大的财务负担。
• 损害研究诚信：使用特征不明或受污染的培养物会损害研究结果的可信度。

细菌培养物保藏的基本技术

有几种技术对于维持健康可靠的细菌培养物至关重要。这些技术包括划线接种、系列稀释、传代培养和低温保存。我们将对每种技术进行详细探讨。

1. 划线接种以分离和纯化

划线接种是一种基本技术，用于从混合培养物中分离单个细菌菌落或确保现有培养物的纯度。该方法涉及在琼脂平板表面稀释细菌样品，以获得分离良好的单个菌落。

操作步骤：

1. 接种环灭菌：用火焰灼烧无菌接种环至发红。待其完全冷却后使用。
2. 获取样品：用接种环轻轻接触细菌培养物。
3. 第一区划线：将接种环轻轻划过琼脂平板的一个小区域（第一区）。
4. 灼烧并冷却接种环：再次灼烧接种环并待其冷却。
5. 第二区划线：将接种环穿过先前划线的区域（第一区），并在平板的新区域（第二区）上划线。
6. 重复操作第3和第4区：灼烧并冷却接种环，然后对第3和第4区重复此过程，每次都从前一个划线区域开始。
7. 培养：在适合所培养细菌种类的温度下培养平板。

预期结果：在后续区域（通常是第3和第4区）应出现分离良好的单个菌落。选择一个分离良好的单菌落进行进一步培养或储存。

全球差异：预制琼脂平板的可用性在全球各地的实验室可能有所不同。虽然方便，但它们可能更昂贵。许多实验室，特别是在发展中国家，会用脱水培养基自行制备琼脂平板以降低成本。

2. 系列稀释以精确计数

系列稀释用于降低样品中细菌的浓度，从而能够精确计数每毫升的菌落形成单位（CFU）。该技术对于定量微生物学和确定培养物的活性至关重要。

操作步骤：

1. 准备稀释空白管：准备一系列装有已知体积无菌稀释液（如磷酸盐缓冲盐水、生理盐水）的无菌试管或瓶子。常用稀释度为1:10 (10^-1)、1:100 (10^-2)、1:1000 (10^-3) 等。
2. 进行系列稀释：将已知体积的细菌培养物转移到第一个稀释空白管中。充分混合。
3. 重复稀释：从第一个稀释空白管中转移相同体积到下一个，每次都充分混合。对所有稀释空白管重复此过程。
4. 涂布稀释液：从每个稀释度中取已知体积（如0.1毫升或1毫升）涂布到琼脂平板上。将接种物均匀地铺在琼脂表面。
5. 培养：在适合该细菌种类的温度下培养平板。
6. 计数菌落：对菌落数在30-300个之间的平板进行计数。使用以下公式计算CFU/mL：

CFU/mL = (Number of Colonies) / (Volume Plated in mL) x (Dilution Factor)

示例：如果您从10^-6稀释液中涂布0.1毫升，并计数到150个菌落，则CFU/mL为： (150 / 0.1) x 10⁶ = 1.5 x 10⁹ CFU/mL

全球差异：所用稀释液的类型可能因当地可用性和实验室偏好而异。磷酸盐缓冲盐水（PBS）是常用选择，但生理盐水甚至无菌蒸馏水也可以是合适的替代品。

3. 传代培养以维持活性

传代培养涉及将细菌从现有培养物转移到新鲜的生长培养基中。这一过程为细菌提供新鲜营养，并防止有毒代谢产物的积累，从而维持培养物的活性和活力。传代培养的频率取决于细菌种类和储存条件。

操作步骤：

1. 准备新鲜培养基：准备无菌的生长培养基（如琼脂平板或肉汤）。
2. 灭菌接种环：灼烧并冷却无菌接种环。
3. 转移细菌：用接种环轻轻接触细菌培养物，并将少量细菌转移到新鲜培养基中。
4. 划线或接种：如果使用琼脂平板，则进行划线以分离。如果使用肉汤，则通过旋转接种环来接种肉汤。
5. 培养：在适当的温度下培养。

频率：对于活跃生长的培养物，通常建议每1-2周传代一次。然而，一些挑剔的微生物可能需要更频繁的传代。应根据您培养物的具体需求制定一个时间表。

全球差异：用于传代培养的培养基类型在很大程度上取决于具体的细菌种类。像LB（溶菌肉汤）和营养琼脂这样的标准培养基被广泛使用，但某些微生物可能需要专门的培养基。在一些地区，获取专门培养基可能是一个挑战，这导致培养方案的差异。

4. 低温保存以长期储存

低温保存涉及在超低温（通常为-80°C或在液氮中）下冷冻细菌培养物，以长期保存它们。这种方法会停止代谢活动，防止遗传漂变并保持培养物的特性。低温保存是长期储存细菌菌株的金标准。

操作步骤：

1. 制备冷冻保护剂：在合适的生长培养基中制备浓度为10-20%的冷冻保护溶液，如甘油或二甲基亚砜（DMSO）。甘油因其毒性较低而通常是首选。
2. 收集细菌：从新鲜、活跃生长的培养物中收集细菌。
3. 与冷冻保护剂混合：在无菌冻存管中将细菌培养物与冷冻保护溶液混合。冷冻保护剂的最终浓度应为10-20%。
4. 逐步冷冻：逐步冷冻冻存管以减少可能损害细胞的冰晶形成。一种常见方法是将冻存管放入-80°C的冷冻盒（如泡沫塑料盒）中过夜，然后转移到液氮中进行长期储存。一些实验室使用程序降温仪进行更精确的冷却。
5. 储存于液氮或-80°C冰箱中：将冻存管转移到液氮（-196°C）或-80°C冰箱中进行长期储存。

复苏冷冻培养物：

1. 快速解冻：在37°C水浴中快速解冻冻存管。
2. 稀释并涂板：立即将解冻的培养物在合适的生长培养基中稀释并涂布到琼脂平板上。
3. 培养：在适当的温度下培养平板。

甘油菌种：一个实践示例

假设您有一个想要保存的大肠杆菌培养物。您需要：

1. 将大肠杆菌在LB肉汤中过夜培养。
2. 在一个冻存管中，将0.5毫升的过夜培养物与0.5毫升的无菌50%甘油混合（最终甘油浓度为25%）。
3. 将冻存管放入-80°C冰箱过夜，然后转移到液氮中进行长期储存。

全球差异：在某些地区，液氮的供应可能有限，这使得-80°C冰箱成为低温保存的主要选择。虽然-80°C储存不如液氮理想，但如果操作正确，仍可提供有效的长期保存。-80°C冰箱的质量和维护也是关键因素，因为温度波动会损害冷冻培养物的活性。

培养物保藏中常见问题的故障排除

尽管遵循了最佳实践，但在培养物保藏过程中仍可能出现问题。以下是一些常见问题及其解决方案：

1. 污染

污染是细菌培养中的一个主要问题。它可能是由无意中进入培养物的细菌、真菌或其他微生物引起的。

污染迹象：

• 肉汤培养物浑浊：肉汤培养物中出现意外的混浊或沉淀。
• 异常菌落形态：菌落的形状、大小或颜色与预期不同。
• 真菌生长：琼脂平板上出现毛茸茸或霉菌样的生长物。
• 难闻气味：培养物散发出恶臭或异常气味。

预防：

• 无菌技术：严格遵守无菌技术至关重要。这包括对所有材料进行灭菌，并在无菌环境（如层流罩）中工作。
• 无菌培养基和耗材：仅使用无菌的培养基、水和一次性耗材。
• 定期监测：定期检查培养物是否有污染迹象。
• 过滤除菌：对热敏培养基和溶液进行过滤除菌。

补救措施：

• 丢弃受污染的培养物：如果培养物被污染，应立即丢弃。不要试图挽救它。
• 确定污染源：尝试找出污染源，以防再次发生。
• 消毒设备：彻底消毒所有可能接触到污染物的设备和表面。

全球差异：层流罩的可用性和成本在不同地区差异很大。在资源有限的环境中，研究人员可能需要依赖替代策略来保持无菌，例如在指定的洁净区域工作并使用便携式紫外线消毒器。

2. 活性丧失

由于营养耗尽、有毒代谢产物积累或储存条件不当，细菌培养物可能会丧失活性。

活性丧失的迹象：

• 生长缓慢：与以前的培养物相比，生长速度减慢。
• 菌落形成不良：琼脂平板上出现小或轮廓不清的菌落。
• 不生长：传代后无法生长。

预防：

• 定期传代：定期传代培养物以提供新鲜营养并去除代谢产物。
• 适当的储存条件：在适当的温度和湿度下储存培养物。
• 低温保存：对培养物进行低温保存以长期储存。

补救措施：

• 检查培养基：确保生长培养基仍然有效且未过期。
• 优化生长条件：优化生长条件，如温度、pH和通气。
• 从冷冻菌种复苏：如果培养物已丧失活性，若有冷冻菌种，则从中复苏。

3. 遗传漂变

遗传漂变指的是培养物中随时间累积的基因突变。这会改变菌株的特性并影响实验结果。

遗传漂变的迹象：

• 表型变化：菌落形态、生长速率或其他可观察特性的改变。
• 质粒丢失：含有重要基因的质粒丢失。
• 抗生素抗性变化：抗生素抗性谱的改变。

预防：

• 尽量减少传代：减少传代次数，以最大限度地减少突变累积的机会。
• 低温保存：尽早对培养物进行低温保存，并将其用作实验的主要来源。
• 定期鉴定：定期鉴定培养物，以监测其特性的变化。

补救措施：

• 从早期菌种复苏：如果怀疑发生遗传漂变，应从早期的冷冻菌种中复苏。
• 重新分离菌株：从单个菌落中重新分离菌株，以获得同质群体。

全球实验室环境的最佳实践

实施最佳实践对于全球各实验室实现一致和可靠的培养物保藏至关重要。这些实践涉及影响培养物质量的技术方面和组织因素。

1. 标准化操作规程

为所有培养物保藏程序建立并维护标准化的操作规程。这确保了不同研究人员和实验室之间的一致性和可重复性。规程应包括详细的说明、所需材料清单以及评估培养物质量的明确标准。

全球合作：与国际研究团队合作时，分享和比较操作规程，以确定潜在的变异来源并协调程序。

2. 质量控制措施

实施质量控制措施以监测细菌培养物的健康和纯度。这包括：

• 定期革兰氏染色：进行革兰氏染色以检查纯度并识别任何污染微生物。
• 生长曲线分析：监测培养物的生长速率以检测活性或生长特性的任何变化。
• 抗生素敏感性测试：定期测试培养物的抗生素敏感性，以监测抗性的发展。
• 基因型分析：考虑进行基因型分析（如PCR、测序），以确认菌株的身份并检测任何基因突变。

国际标准：遵守国际公认的质量控制标准，例如由美国典型培养物保藏中心（ATCC）或其他相关组织制定的标准。

3. 正确的标签和记录

对所有培养物保藏活动进行细致的记录。这包括：

• 菌株标识：用菌株名称、来源日期、传代次数和任何其他相关信息清楚地标记所有培养物。
• 传代历史：跟踪每个培养物的传代历史，包括每次传代的日期和所用培养基。
• 储存位置：记录所有冷冻菌种的位置。
• 污染事件：记录任何污染事件以及为解决这些问题所采取的步骤。

数字数据库：利用数字数据库或实验室信息管理系统（LIMS）高效、安全地管理培养物信息。这有助于跨实验室的数据共享与协作。

4. 培训与教育

为所有参与培养物保藏的人员提供全面的培训。这包括无菌技术、培养物处理、故障排除和记录保存的指导。强调遵守标准化操作规程和保持准确记录的重要性。

继续教育：鼓励参加研讨会、会议和在线资源，以了解培养物保藏和微生物学领域的最新进展。

5. 资源分配

确保为培养物保藏提供充足的资源。这包括：

• 设备：提供基本设备，如高压灭菌器、培养箱、层流罩和冰箱。
• 耗材：维持充足的无菌培养基、一次性耗材和冷冻保护剂供应。
• 人员：为培养物保藏活动分配足够的人员时间。

全球伙伴关系：寻求与国际组织或机构的合作，以获取本地可能不易获得的资源和专业知识。

结论

精通细菌培养物保藏对于可靠和可重复的研究、工业应用和教育至关重要。通过实施本指南中概述的技术、故障排除策略和最佳实践，全球的研究人员和专业人士可以确保其细菌培养物的长期活性、纯度和稳定性。遵守标准化操作规程、保持细致的记录以及培养质量控制文化，是在不断发展的微生物学领域取得一致和可靠成果的关键。

通过采纳全球视野并将这些指南应用于当地资源和条件，我们可以共同增进对微生物世界的理解，并利用其潜力造福人类。