发酵放大：全球生物技术进步的综合指南

发酵是一种将糖转化为酸、气体或酒精的代谢过程，是包括食品和饮料、制药、生物燃料和工业酶在内的各个行业的基石。将发酵过程放大，从实验室规模过渡到工业规模的生产，带来了重大挑战，需要深入了解生物工艺工程原理。本指南提供了发酵放大的全面概述，涵盖了关键概念、挑战、技术和策略，以帮助全球各行业的成功生物工艺优化。

为什么发酵放大很重要？

有效放大发酵工艺的能力对于生物技术创新商业化至关重要。虽然在实验室规模下可能取得有希望的结果，但将这些结果转化为大规模生产需要仔细考虑各种因素，包括：

• 保持工艺性能：确保在规模增加时保持所需的产物产量、质量和生产力。
• 成本效益：优化工艺以最大限度地降低生产成本并最大化盈利能力。
• 法规遵从性：满足不同全球市场对产品安全性和有效性的严格监管要求。
• 满足市场需求：生产足够数量的产品以满足市场需求。

成功应对发酵放大的复杂性对于希望将其生物技术产品商业化并在全球市场中获得竞争优势的公司至关重要。例如，一家制药公司通过微生物发酵开发一种新的抗生素，需要确保发酵过程可以放大，以生产足够的药物来满足全球患者的需求。同样，一家旨在从木质纤维素生物质中生产乙醇的生物燃料公司，需要优化大规模生产的发酵过程，以使生物燃料成为化石燃料的可行替代品。

发酵放大的关键原理

成功的发酵放大依赖于生物工艺工程的几个基本原理。理解和应用这些原理对于在工业规模上实现最佳工艺性能至关重要。

1. 保持恒定的体积传质系数 (kLa)

氧气转移通常是好氧发酵过程中的一个限制因素。体积传质系数 (kLa) 是一个关键参数，它描述了氧气从气相转移到生物反应器液相的速率。在放大过程中保持恒定的kLa对于确保细胞获得足够的氧气以供生长和产物形成至关重要。这可以通过调整搅拌速度、通气速率和生物反应器几何形状等参数来实现。

例如，在通过黑曲霉生产柠檬酸的过程中，氧气限制会显著降低柠檬酸的产量。在整个发酵过程中保持足够的kLa对于最大限度地提高柠檬酸的产量至关重要。可以采用不同的策略，例如使用富氧空气或优化叶轮设计，以增强氧气转移。

2. 保持恒定的混合时间

有效的混合对于确保生物反应器的均一性、防止底物或营养物质的限制以及耗散热量至关重要。在放大过程中保持恒定的混合时间对于确保细胞体验均匀的环境以及最大限度地减少营养物质、pH值和温度的梯度非常重要。混合时间会受到叶轮设计、叶轮转速和生物反应器几何形状等因素的影响。

考虑在哺乳动物细胞培养物中生产重组蛋白。哺乳动物细胞对剪切敏感，过度搅拌会损坏细胞并降低蛋白质产量。然而，混合不足会导致营养物质限制和细胞聚集。优化混合时间以平衡这些相互竞争的因素对于成功的放大至关重要。

3. 保持恒定的剪切速率

剪切速率，即相邻流体层相对于彼此移动的速率，会对细胞活力和产品质量产生重大影响，尤其对于剪切敏感细胞，如哺乳动物细胞和植物细胞。在放大过程中保持恒定的剪切速率对于最大限度地减少细胞损伤并确保一致的产品质量非常重要。可以通过调整叶轮转速和叶轮设计等参数来控制剪切速率。

例如，在CHO细胞中生产单克隆抗体时，过度的剪切应力会导致细胞裂解和细胞内蛋白酶的释放，这会降解抗体。使用低剪切叶轮和优化搅拌速度可以帮助最大限度地减少剪切应力并改善抗体生产。

4. 保持恒定的单位体积功率输入 (P/V)

单位体积功率输入 (P/V) 是衡量输入生物反应器用于混合和充气的能量的指标。在放大过程中保持恒定的P/V可以帮助确保生物反应器的混合和氧气转移特性在不同规模下相似。然而，需要注意的是，P/V并不是影响混合和氧气转移的唯一因素，还应考虑叶轮设计和生物反应器几何形状等其他参数。

在许多细菌发酵中，由于细菌细胞的稳健性高于哺乳动物细胞，因此可能可以接受较高的P/V。然而，即使在细菌发酵中，过度的P/V也可能导致能耗增加，并可能在某些情况下导致细胞损伤。因此，优化P/V以及其他参数至关重要。

5. 几何相似性

在放大过程中保持几何相似性意味着生物反应器尺寸（例如，直径、高度、叶轮直径）的比例保持不变。这可以帮助确保生物反应器的流动模式和混合特性在不同规模下相似。然而，由于成本和空间限制等实际约束，通常不可能保持完美的几何相似性。此外，完美的几何相似性并不能保证相同的性能，因为流体动力学并不仅仅由几何形状决定。

例如，几何相似的生物反应器可能具有不同的表面积与体积比，这会影响传热和蒸发速率。可以使用计算流体动力学 (CFD) 建模来评估偏离几何相似性对生物反应器性能的影响。

发酵放大中的挑战

放大发酵过程带来了许多挑战，需要仔细考虑可能影响工艺性能的各种因素。

1. 氧气转移限制

随着生物反应器规模的增加，保持细胞足够的氧气转移变得更加困难。这是因为表面积与体积的比率降低，并且氧气的扩散路径增加。氧气限制可能导致细胞生长减少、产物形成减少，甚至细胞死亡。

解决方案：

• 增加通气速率。
• 增加搅拌速度。
• 使用富氧空气或纯氧。
• 优化叶轮设计。
• 使用具有更大表面积与体积比的生物反应器。
• 实施诸如使用微气泡或膜曝气之类的策略。

2. 散热

发酵过程会因代谢活动和搅拌而产生热量。随着生物反应器规模的增加，去除这种热量变得更加困难，这可能导致温度升高，并降低细胞生长和产物形成。保持最佳温度对于酶活性和整体细胞健康至关重要。

解决方案：

• 使用带有冷却夹套或内部冷却盘管的生物反应器。
• 增加冷却剂的流量。
• 使用更有效的冷却系统。
• 优化发酵过程以减少热量产生。
• 如果合适（且不担心挥发性产物的损失），则考虑蒸发冷却。

3. 混合不均匀性

随着生物反应器规模的增加，保持整个容器内的均匀混合变得更加困难。这可能导致营养物质、pH值和温度的梯度，这会对细胞生长和产物形成产生负面影响。死区或混合不良的区域也可能促进有毒副产物的积累。

解决方案：

• 优化叶轮设计。
• 增加搅拌速度。
• 使用多个叶轮。
• 优化生物反应器几何形状。
• 采用CFD建模来理解和优化混合模式。

4. pH值控制

保持最佳pH值对于细胞生长和产物形成至关重要。随着生物反应器规模的增加，保持整个容器内的均匀pH值变得更加困难。这可能导致pH值梯度，这会对细胞生长和产物形成产生负面影响。代谢副产物会显著改变pH值，需要严格控制。

解决方案：

• 使用带有酸和碱添加的pH值控制系统。
• 优化pH值探针的位置和酸/碱添加点。
• 使用缓冲液来帮助保持稳定的pH值。
• 考虑使用在线pH值监测和控制系统。

5. 泡沫控制

泡沫形成是发酵过程中的一个常见问题，尤其是在涉及蛋白质或表面活性剂的情况下。泡沫可能导致工作体积减少、污染以及传感器和过滤器的堵塞。它还会阻碍氧气转移。

解决方案：

• 添加消泡剂。
• 优化搅拌和通气速率。
• 使用机械消泡器。
• 考虑使用泡沫传感器来自动添加消泡剂。

6. 形态或生理学变化

随着规模的增加，细胞可能会表现出改变的形态或生理学。剪切应力或生物反应器环境中的其他变化可能导致细胞产生不同的蛋白质或具有不同的生长速率。这些变化会影响产品产量和质量。这在丝状生物或聚集细胞培养物中尤为普遍。

解决方案：

• 在放大过程中仔细监测细胞形态和生理学。
• 调整发酵参数（例如，温度、pH值、营养水平）以保持最佳细胞生长和产物形成。
• 考虑使用种子培养链逐渐使细胞适应更大规模的环境。
• 采用过程分析技术 (PAT) 来实时监测关键过程参数。

7. 保持无菌

保持无菌对于防止污染和确保产品质量至关重要。随着生物反应器规模的增加，由于表面积增加以及连接和采样点的增加，保持无菌变得更加困难。

解决方案：

• 对所有设备和培养基使用经过验证的灭菌程序。
• 在操作过程中实施严格的无菌技术。
• 使用无菌过滤器进行空气和气体流。
• 定期监测生物反应器是否受到污染。
• 确保正确密封所有连接和端口。

发酵放大的技术

有多种技术可用于协助发酵放大和优化。这些技术可以帮助克服与放大发酵过程相关的挑战，并提高工艺性能。

1. 计算流体动力学 (CFD)

CFD是模拟生物反应器中流体流动、传热和传质的强大工具。CFD可用于优化生物反应器设计、预测混合模式和识别死区。CFD建模可以帮助根据小规模实验预测更大规模下的条件，从而减少所需的高成本中试规模运行次数。

示例：CFD可用于优化大型生物反应器中叶轮的设计和放置，以确保均匀的混合和氧气转移。它还可以识别剪切应力高的区域，从而使工程师能够调整设计以最大限度地减少细胞损伤。

2. 过程分析技术 (PAT)

PAT是一个系统，旨在通过及时测量（即在加工过程中）原材料和在制品以及工艺的关键质量属性和性能属性来设计、分析和控制制造，其目标是确保最终产品的质量。PAT工具包括用于监测pH值、温度、溶解氧、细胞密度和营养水平的传感器。实时数据采集允许对发酵过程进行即时调整，从而提高效率和可重复性。

示例：使用在线近红外 (NIR) 光谱仪监测发酵液中的葡萄糖水平，可以实时调整进料速率，防止葡萄糖限制或过量进料，这两种情况都会对产品产量产生负面影响。

3. 实验的统计设计 (DoE)

DoE是一种系统的方法，用于计划和进行实验，以确定过程的最佳操作条件。DoE可用于优化发酵参数，如温度、pH值、营养水平和通气速率。DoE是一种比传统的“一次一个因素”实验更有效的方法。

示例：使用DoE来优化发酵培养基中不同营养物质的浓度可以显著提高产品产量。这种统计方法允许识别营养物质之间的相互作用，这些相互作用可能无法通过传统实验显现出来。

4. 先进的生物反应器设计

已经开发了几种先进的生物反应器设计，以提高工艺性能。这些包括：

• 气升式生物反应器：这些生物反应器使用空气提供混合和氧气转移。它们特别适用于剪切敏感细胞。
• 膜式生物反应器：这些生物反应器使用膜将细胞与发酵液分离，从而实现高细胞密度和连续的产品去除。
• 波浪式生物反应器：这些生物反应器使用摇摆运动来提供混合和曝气。它们特别适用于细胞培养应用。
• 一次性生物反应器：这些生物反应器是预先灭菌和一次性的，无需清洁和灭菌，从而降低了污染的风险。

示例：一次性生物反应器越来越多地用于生物制药行业中单克隆抗体的生产。这些生物反应器提供了几个优点，包括降低资本投资、更快的周转时间和降低污染风险。

5. 缩小模型

缩小模型是小型生物反应器，旨在模拟大型生物反应器中的条件。缩小模型可用于研究不同过程参数对细胞生长和产物形成的影响，而无需在大规模生物反应器中进行实验。这节省了时间和资源。

示例：可以使用缩小模型来模拟大型生物反应器中的氧气转移限制。通过研究氧气限制对缩小模型中细胞生长和产物形成的影响，工程师可以制定策略来克服大型生物反应器中的这些限制。

成功发酵放大的策略

成功的发酵放大需要一个经过良好规划和执行的策略，以应对挑战并利用现有技术。

1. 彻底的工艺理解

深入了解发酵过程对于成功的放大至关重要。这包括了解所涉及的代谢途径、细胞的最佳生长条件以及影响产品产量和质量的关键过程参数。了解潜在的抑制因素也很关键。建立在特征明确的小规模实验基础上的坚实基础至关重要。

2. 开发强大的种子培养链

强大的种子培养链对于确保细胞在转移到大型生物反应器时健康且积极生长至关重要。种子培养链应设计为逐步使细胞适应更大规模的环境。这通常涉及从摇瓶中的小接种物开始，并通过一系列逐渐增大的生物反应器逐渐增加接种物的体积。

3. 实施阶段适当的方法

阶段适当的方法意味着严格程度和文件编制应与开发阶段相称。早期阶段的工艺开发可能侧重于确定最佳发酵参数，而后期阶段的工艺开发应侧重于优化和验证工艺，以确保一致的产品质量和可重复性。

4. 进行中试规模研究

中试规模研究是放大过程中的一个重要步骤。中试规模研究允许您在大小更接近大规模生物反应器的生物反应器中测试发酵过程。这使您能够在进入全面生产之前识别潜在问题并优化流程。中试规模研究可能会发现混合、传热或pH值控制方面的问题，这些问题在较小规模下并不明显。

5. 监测关键过程参数

持续监测关键过程参数 (CPP) 对于确保一致的产品质量和可重复性至关重要。CPP包括温度、pH值、溶解氧、细胞密度和营养水平。实时监测允许立即调整发酵过程，防止偏离最佳操作条件。

6. 实施过程控制策略

过程控制策略对于将发酵过程维持在所需的操作范围内至关重要。这包括实施反馈控制循环，以自动调整温度、pH值和溶解氧等参数。高级控制策略，如模型预测控制 (MPC)，可用于实时优化发酵过程。

7. 制定彻底的清洁和灭菌方案

彻底的清洁和灭菌方案对于防止污染和确保产品质量至关重要。该方案应包括清洁和灭菌所有设备和培养基的详细程序。应验证清洁和灭菌方案的有效性，以确保其能够去除所有污染物。

8. 文件记录和可追溯性

详细的文件记录对于证明发酵过程得到良好控制并且产品符合所有质量要求至关重要。这包括记录所有工艺参数、原材料和分析结果。应维护一个全面的审计跟踪，以确保所有数据的可追溯性。

全球发酵放大案例研究

考察来自全球的成功发酵放大案例，可以提供宝贵的见解和经验教训。

1. 丹麦胰岛素生产

丹麦制药公司诺和诺德是胰岛素生产领域的全球领导者。该公司已成功地放大了其用于酿酒酵母中重组胰岛素生产的发酵工艺。他们成功的关键在于实施了先进的工艺控制策略和使用一次性生物反应器。他们还采用了先进的下游加工技术，以纯化胰岛素，以满足全球严格的监管要求。

2. 巴西生物燃料生产

巴西是甘蔗乙醇生产的世界领导者。巴西公司已经开发了高效的发酵工艺来生产乙醇，乙醇被用作生物燃料。这些工艺的放大涉及优化用于发酵的酵母菌株，提高发酵过程的效率，以及开发强大的下游加工技术。通常采用连续发酵。

3. 印度抗生素生产

印度是抗生素的主要生产国。印度制药公司已成功地放大了其用于生产各种抗生素的发酵工艺，包括青霉素和头孢菌素。这涉及优化发酵条件，提高发酵过程的效率，以及开发强大的下游加工技术。他们还侧重于具有成本效益的生产策略，以便在全球市场上竞争。

4. 中国工业酶生产

中国是工业酶的重要生产国。中国公司已经放大了其用于生产各种酶的发酵工艺，包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶。这些酶被用于广泛的行业，包括食品和饮料、纺织品和洗涤剂。使用转基因生物 (GMO) 的高效大规模发酵是常见做法。挑战包括处理各种原材料和维护质量控制。

发酵放大的未来

发酵放大领域正在不断发展，新的技术和策略正在开发中，以提高工艺性能并降低成本。发酵放大中的一些主要趋势包括：

• 增加自动化和机器人技术的使用：自动化和机器人技术可以帮助提高发酵过程的效率和可重复性。
• 开发更高效的生物反应器设计：正在开发新的生物反应器设计，以改善混合、氧气转移和传热。
• 增加过程分析技术 (PAT) 的使用：PAT可以帮助实时监测关键过程参数，从而允许对发酵过程进行即时调整。
• 数据分析和人工智能 (AI) 的集成：数据分析和人工智能可用于优化发酵过程并预测工艺性能。
• 注重可持续性：各公司越来越关注开发可持续的发酵过程，以最大限度地减少浪费和能源消耗。

结论

发酵放大是一个复杂而具有挑战性的过程，但它对于商业化生物技术创新至关重要。通过了解发酵放大的关键原理、解决挑战、利用现有技术并实施精心规划的策略，公司可以成功地扩大其发酵过程，并在全球市场中获得竞争优势。持续创新和对可持续性的关注将对全球发酵技术的未来至关重要。