Масштабування: Комплексний посібник з комерційної ферментації

Ферментація є наріжним каменем багатьох галузей промисловості, від харчової та напоїв до фармацевтики та біопалива. Хоча успішна ферментація в лабораторних масштабах є значним досягненням, перенесення цього успіху на комерційне виробництво вимагає ретельного планування, виконання та оптимізації. Цей посібник надає комплексний огляд ключових аспектів та найкращих практик для масштабування комерційних процесів ферментації.

Чому масштабування ферментації є складним завданням?

Масштабування процесу ферментації — це не просто збільшення об'єму. Декілька факторів, які легко контролювати в малому масштабі, стають значно складнішими зі зростанням процесу. До них належать:

• Теплообмін: Підтримка оптимальної температури є вирішальною для росту мікроорганізмів та утворення продукту. Більші біореактори мають менше співвідношення площі поверхні до об'єму, що ускладнює відведення тепла. Недостатнє охолодження може призвести до перегріву та загибелі клітин, тоді як надмірне охолодження може сповільнити процес ферментації.
• Масообмін: Перенесення кисню часто є обмежуючим фактором в аеробних ферментаціях. Зі збільшенням щільності культури зростає потреба в кисні. Забезпечення достатнього постачання кисню по всьому біореактору стає все складнішим у великих масштабах. Перемішування, барботування та дизайн реактора відіграють вирішальну роль в ефективності перенесення кисню.
• Перемішування: Ефективне перемішування є важливим для підтримки гомогенності, розподілу поживних речовин та видалення метаболічних побічних продуктів. Погане перемішування може призвести до градієнтів pH, температури та концентрації поживних речовин, що негативно впливає на ріст клітин та утворення продукту. Тип та конфігурація імпелерів, дизайн відбійних перегородок та швидкість перемішування повинні бути ретельно продумані.
• Зсувне напруження: Надмірне зсувне напруження від імпелерів може пошкодити клітини, особливо ті, що чутливі до зсуву. Оптимізація дизайну імпелера та швидкості перемішування є вирішальною для мінімізації зсувного напруження при збереженні адекватного перемішування. Деякі клітини (наприклад, нитчасті гриби) більш схильні до пошкодження зсувом, ніж інші.
• Стерильність: Підтримка стерильності є першочерговою у процесах ферментації. Ризик контамінації зростає з розміром та складністю біореактора. Надійні процедури стерилізації, асептичні методи та закриті системи є необхідними для запобігання контамінації та забезпечення якості продукту.
• Контроль pH: Підтримання оптимального діапазону pH є критичним для активності ферментів та життєздатності клітин. У міру протікання ферментації утворення кислот або лугів може спричинити значні коливання pH. Точний контроль pH вимагає складних систем моніторингу та управління.
• Моніторинг та контроль процесу: Ефективний моніторинг та контроль критичних параметрів процесу (наприклад, температури, pH, розчиненого кисню, рівня поживних речовин) є вирішальними для стабільної продуктивності та якості продукту. Системи моніторингу в реальному часі та автоматизованого контролю є необхідними для великомасштабних ферментацій.
• Масштабозалежні метаболічні зміни: Клітини можуть поводитися по-різному у великомасштабних ферментерах порівняно з культурами малого масштабу. Фактори, такі як доступність кисню, зсувне напруження та градієнти поживних речовин, можуть змінювати метаболічні шляхи та впливати на вихід та якість продукту. Ці зміни необхідно ретельно вивчати та враховувати під час масштабування.

Етапи масштабування ферментації

Процес масштабування зазвичай включає кілька етапів, кожен з яких має свої цілі та виклики:

1. Розробка посівної культури

Посівна культура служить інокулятом для виробничого ферментера. Важливо розробити здорову, активно зростаючу та вільну від контамінації посівну культуру. Це зазвичай включає кілька стадій росту, починаючи з кріоконсервованої вихідної культури та переходячи через колби для струшування, малі біореактори і, нарешті, до посівного ферментера. Посівна культура повинна бути фізіологічно схожою на клітини, які бажано отримати у виробничому ферментері.

Приклад: Фармацевтична компанія, що розробляє новий антибіотик, може почати із замороженого стоку мікроорганізму-продуцента. Цей сток відновлюють у колбі для струшування, потім переносять у малий (наприклад, 2 л) біореактор. Біомаса з цього біореактора потім інокулює більший (наприклад, 50 л) посівний ферментер, який забезпечує інокулят для виробничого ферментера.

2. Пілотна ферментація

Пілотна ферментація є мостом між лабораторією та промисловим виробництвом. Вона дозволяє тестувати та оптимізувати процес ферментації в умовах, які більше нагадують повномасштабне виробниче середовище. Дослідження на пілотному рівні допомагають виявити потенційні проблеми масштабування та вдосконалити робочі параметри. Ці експерименти зазвичай включають біореактори об'ємом від 50 до 500 літрів.

Приклад: Компанія з виробництва біопалива може використовувати 100-літровий біореактор для оцінки продуктивності нового генетично модифікованого штаму дріжджів для виробництва етанолу. Вони б оптимізували такі параметри, як температура, pH та швидкість подачі поживних речовин, щоб максимізувати вихід та продуктивність етанолу.

3. Промислова ферментація

Завершальною стадією є промислова ферментація, де продукт виробляється у великих кількостях для комерційного продажу. Біореактори промислового масштабу можуть мати об'єм від кількох тисяч до сотень тисяч літрів. Підтримка стабільної продуктивності та якості продукту на цьому рівні вимагає ретельної уваги до деталей та надійних систем контролю процесу.

Приклад: Пивоварня може використовувати 10 000-літровий ферментер для виробництва пива в комерційних масштабах. Вони б ретельно контролювали рівні температури, pH та розчиненого кисню, щоб забезпечити стабільний смак та якість.

Ключові аспекти масштабування ферментації

1. Дизайн біореактора

Біореактор — це серце процесу ферментації. Вибір правильного дизайну біореактора є вирішальним для успішного масштабування. Ключові аспекти включають:

• Тип біореактора: Різні типи біореакторів підходять для різних застосувань. Реактори з перемішуванням є найпоширенішим типом, але існують і інші варіанти, такі як ерліфтні реактори, бульбашкові колонні реактори та реактори з насадкою. Вибір залежить від конкретних вимог процесу ферментації, таких як тип мікроорганізму, потреба в кисні та чутливість до зсувного напруження.
• Система перемішування: Система перемішування повинна забезпечувати адекватне перемішування для гомогенності, розподілу поживних речовин та перенесення кисню. Поширені типи імпелерів включають турбіни Раштона, турбіни з похилими лопатками та морські пропелери. Кількість та конфігурація імпелерів, дизайн відбійних перегородок та швидкість перемішування повинні бути оптимізовані для конкретного біореактора та процесу ферментації.
• Система барботування: Система барботування подає повітря або кисень у біореактор. Тип та розмір барботера, швидкість потоку газу та склад газу повинні ретельно контролюватися для оптимізації перенесення кисню без надмірного піноутворення або пошкодження клітин.
• Система теплообміну: Система теплообміну повинна підтримувати біореактор при оптимальній температурі для росту клітин та утворення продукту. Зазвичай це включає ємність з сорочкою, в якій циркулює охолоджувальна або нагрівальна рідина. Потужність теплообміну повинна бути достатньою для відведення тепла, що виділяється в процесі ферментації.
• Прилади та контроль: Біореактор повинен бути оснащений датчиками та системами контролю для моніторингу та регулювання критичних параметрів процесу, таких як температура, pH, розчинений кисень та рівень поживних речовин. Автоматизовані системи контролю є необхідними для підтримки стабільної продуктивності та якості продукту.

2. Оптимізація процесу

Оптимізація процесу включає виявлення та оптимізацію ключових параметрів процесу, які впливають на ріст клітин, утворення продукту та його якість. Зазвичай це включає комбінацію експериментальних досліджень та математичного моделювання.

• Оптимізація середовища: Ферментаційне середовище повинно забезпечувати всі поживні речовини, необхідні для росту клітин та утворення продукту. Оптимізація складу середовища може значно покращити вихід та продуктивність. Це може включати зміну концентрацій джерел вуглецю, джерел азоту, вітамінів та мінералів. Для ефективної оптимізації складу середовища можна використовувати статистичні плани експерименту, такі як методологія поверхні відгуку (RSM).
• Оптимізація температури: Оптимальна температура для росту клітин та утворення продукту залежить від конкретного мікроорганізму. Температура може впливати на активність ферментів, плинність мембран та стабільність білків. Оптимальну температуру слід визначати експериментально.
• Оптимізація pH: Оптимальний діапазон pH для росту клітин та утворення продукту також залежить від конкретного мікроорганізму. pH може впливати на активність ферментів, проникність клітинних мембран та розчинність білків. Точний контроль pH є необхідним для оптимальної продуктивності ферментації.
• Оптимізація розчиненого кисню: Підтримка адекватного рівня розчиненого кисню є вирішальною для аеробних ферментацій. Оптимальний рівень розчиненого кисню залежить від потреби мікроорганізму в кисні та киснепереносної здатності біореактора. Рівень розчиненого кисню можна контролювати, регулюючи швидкість перемішування, швидкість аерації та збагачення киснем.
• Стратегії живлення: Для періодичних з підживленням та безперервних ферментацій швидкість та склад підживлення повинні бути ретельно оптимізовані для максимізації виходу та продуктивності. Можна використовувати стратегії керування зі зворотним зв'язком для регулювання швидкості підживлення на основі вимірювань концентрації глюкози, pH або розчиненого кисню в реальному часі.

3. Моніторинг та контроль

Ефективний моніторинг та контроль критичних параметрів процесу є необхідними для стабільної продуктивності та якості продукту. Це вимагає використання відповідних датчиків, систем контролю та методів аналізу даних.

• Датчики: Для моніторингу критичних параметрів процесу доступні різні датчики, включаючи датчики температури, pH, розчиненого кисню, концентрації глюкози, концентрації біомаси та концентрації продукту. Вибір датчика залежить від конкретного вимірюваного параметра та вимог процесу ферментації.
• Системи контролю: Автоматизовані системи контролю використовуються для регулювання параметрів процесу на основі зворотного зв'язку від датчиків. Поширені системи контролю включають ПІД-регулятори (пропорційно-інтегрально-диференціальні), які регулюють керовані змінні (наприклад, температуру, pH, швидкість перемішування) для підтримки бажаних заданих значень.
• Аналіз даних: Дані, зібрані з датчиків та систем контролю, можна аналізувати для виявлення тенденцій, виявлення аномалій та оптимізації продуктивності процесу. Методи статистичного контролю процесів (SPC) можна використовувати для моніторингу варіабельності процесу та виявлення потенційних проблем до того, як вони вплинуть на якість продукту.
• Технологія аналізу процесів (PAT): PAT — це система для розробки, аналізу та контролю виробничих процесів шляхом своєчасних вимірювань критичних атрибутів якості (CQA) та критичних параметрів процесу (CPP). PAT має на меті покращити розуміння процесу, зменшити варіабельність та підвищити якість продукту.

4. Забезпечення стерильності

Підтримка стерильності є першочерговою у процесах ферментації. Контамінація може призвести до псування продукту, зниження виходу та навіть повного провалу процесу. Впровадження надійних процедур стерилізації та асептичних методів є необхідним.

• Стерилізація обладнання: Все обладнання, що контактує з ферментаційним бульйоном, включаючи біореактор, трубопроводи та датчики, повинно бути ретельно стерилізоване перед використанням. Стерилізація парою є найпоширенішим методом, але існують і інші варіанти, такі як автоклавування, фільтрація та хімічна стерилізація.
• Стерилізація середовища: Ферментаційне середовище також повинно бути стерилізоване для усунення будь-яких контамінуючих мікроорганізмів. Зазвичай це робиться шляхом автоклавування або стерилізуючої фільтрації.
• Асептичні методи: Усі операції, що передбачають відкриття біореактора або введення матеріалів у ферментаційний бульйон, повинні виконуватися з використанням асептичних методів. Це включає використання стерильного обладнання, носіння стерильних рукавичок та роботу в чистому середовищі.
• Фільтрація повітря: Повітря, що надходить у біореактор, повинно фільтруватися через стерильні фільтри для видалення будь-яких повітряних мікроорганізмів.
• Закриті системи: Використання закритих систем мінімізує ризик контамінації. Це передбачає з'єднання всього обладнання та трубопроводів у замкнутому контурі та уникнення будь-яких відкритих перенесень матеріалів.

5. Контроль піноутворення

Утворення піни є поширеною проблемою в процесах ферментації, особливо тих, що включають білки або поверхнево-активні речовини. Надмірна піна може призвести до зниження перенесення кисню, контамінації та втрати продукту. Піну можна контролювати шляхом додавання піногасників або використання механічних піноломок.

• Піногасники: Піногасники — це хімічні речовини, які знижують поверхневий натяг ферментаційного бульйону, запобігаючи утворенню піни. Поширені піногасники включають силікони, рослинні олії та жирні кислоти. Вибір піногасника залежить від конкретного процесу ферментації та чутливості мікроорганізму.
• Механічні піноломки: Механічні піноломки використовують обертові лопаті або інші пристрої для фізичного руйнування піни. Їх часто використовують у поєднанні з піногасниками.

Стратегії успішного масштабування

1. Підхід QbD (Якість через дизайн)

QbD — це систематичний підхід до розробки, який починається з попередньо визначених цілей і наголошує на розумінні продукту та процесу, а також на контролі процесу. Застосування принципів QbD до масштабування ферментації допомагає забезпечити стабільну якість продукту та продуктивність.

Ключові елементи QbD включають:

• Визначення цільового профілю якості продукту (QTPP): QTPP описує бажані характеристики кінцевого продукту, такі як чистота, активність та стабільність.
• Визначення критичних атрибутів якості (CQA): CQA — це фізичні, хімічні, біологічні або мікробіологічні властивості, які необхідно контролювати для забезпечення бажаної якості продукту.
• Визначення критичних параметрів процесу (CPP): CPP — це параметри процесу, які можуть впливати на CQA.
• Встановлення простору розробки (Design Space): Простір розробки — це багатовимірна комбінація та взаємодія вхідних змінних (наприклад, CPP) та параметрів процесу, які, як було продемонстровано, забезпечують гарантію якості. Робота в межах простору розробки гарантує, що продукт відповідає бажаним атрибутам якості.
• Впровадження стратегії контролю: Стратегія контролю описує, як CPP будуть відстежуватися та контролюватися, щоб забезпечити, що процес залишається в межах простору розробки, а продукт відповідає бажаним атрибутам якості.

2. Обчислювальна гідродинаміка (CFD)

CFD — це потужний інструмент для моделювання потоку рідини, теплообміну та масообміну в біореакторах. Симуляції CFD можна використовувати для оптимізації дизайну біореактора, систем перемішування та систем барботування. Вони також можуть допомогти виявити потенційні проблеми, такі як мертві зони та гарячі точки зсувного напруження. CFD може зменшити кількість дорогих та трудомістких пілотних експериментів, необхідних для масштабування.

3. Моделі зменшеного масштабу (Scale-Down)

Моделі зменшеного масштабу — це маломасштабні біореактори, розроблені для імітації умов у великомасштабному виробничому біореакторі. Моделі зменшеного масштабу можна використовувати для вивчення впливу різних параметрів процесу на ріст клітин, утворення продукту та його якість. Їх також можна використовувати для усунення проблем, що виникають під час масштабування. Добре охарактеризовані моделі зменшеного масштабу можуть надати цінні знання та прискорити процес розробки.

4. Моделювання та симуляція процесів

Моделювання та симуляція процесів можуть використовуватися для прогнозування поведінки процесу ферментації в різних масштабах та за різних умов експлуатації. Математичні моделі можуть бути розроблені на основі фундаментальних принципів масообміну, теплообміну та кінетики реакцій. Ці моделі можна використовувати для оптимізації параметрів процесу, розробки стратегій контролю та усунення несправностей. Для моделювання та симуляції процесів можна використовувати такі інструменти, як MATLAB, gPROMS та Aspen Plus.

Аспекти даунстрім-процесингу (подальшої обробки)

Аспекти масштабування виходять за рамки самого процесу ферментації. Даунстрім-процесинг, що включає виділення та очищення продукту з ферментаційного бульйону, також потребує масштабування. Вибір методів даунстрім-процесингу залежить від природи продукту, його концентрації та бажаної чистоти. Поширені методи даунстрім-процесингу включають:

• Розділення клітин: Видалення клітин з ферментаційного бульйону часто є першим кроком у даунстрім-процесингу. Це можна зробити шляхом центрифугування, фільтрації або мікрофільтрації.
• Руйнування клітин: Якщо продукт є внутрішньоклітинним, клітини необхідно зруйнувати, щоб вивільнити продукт. Це можна зробити механічними методами (наприклад, гомогенізація, подрібнення бісером) або хімічними методами (наприклад, ферментативний лізис).
• Виділення продукту: Продукт можна виділити з ферментаційного бульйону за допомогою різних методів, включаючи осадження, екстракцію та адсорбцію.
• Очищення продукту: Продукт зазвичай очищують за допомогою хроматографічних методів, таких як афінна хроматографія, іонообмінна хроматографія та гель-фільтрація.
• Формуляція продукту: Останнім кроком у даунстрім-процесингу є формуляція продукту у стабільну та придатну до використання форму. Це може включати додавання допоміжних речовин, стабілізаторів та консервантів.

Глобальні приклади успішного масштабування ферментації

Декілька галузей у всьому світі значною мірою залежать від успішного масштабування ферментації. Ось кілька прикладів:

• Фармацевтична промисловість (глобально): Виробництво антибіотиків, вакцин та інших біофармацевтичних препаратів залежить від великомасштабної ферментації мікроорганізмів або клітинних культур. Такі компанії, як Pfizer, Roche та Novartis, експлуатують величезні ферментаційні потужності по всьому світу.
• Харчова промисловість та виробництво напоїв (Європа, Північна Америка, Азія): Виробництво пива, вина, йогурту, сиру та інших ферментованих продуктів і напоїв залежить від контрольованих процесів ферментації. Такі компанії, як Anheuser-Busch InBev (Бельгія), Danone (Франція) та Kirin Brewery (Японія), вдосконалювали масштабування ферментації протягом багатьох років.
• Біопаливна промисловість (Бразилія, США): Виробництво етанолу з цукрової тростини (Бразилія) та кукурудзи (США) включає великомасштабну ферментацію цукрів дріжджами. Такі компанії, як Raizen (Бразилія) та Archer Daniels Midland (США), експлуатують великомасштабні установки з виробництва біопалива.
• Промислова біотехнологія (Данія, Німеччина, Китай): Виробництво ферментів, біопластику та інших біологічних продуктів залежить від ферментації генетично модифікованих мікроорганізмів. Такі компанії, як Novozymes (Данія), BASF (Німеччина) та Amyris (США), є лідерами в цій галузі.

Усунення поширених проблем масштабування

Незважаючи на ретельне планування та виконання, під час масштабування ферментації все ще можуть виникати проблеми. Ось деякі поширені проблеми та можливі рішення:

• Зниження виходу продукту: Це може бути пов'язано зі змінами метаболічних шляхів, обмеженням поживних речовин або накопиченням інгібуючих побічних продуктів. Перегляньте склад середовища, оптимізуйте стратегії підживлення та забезпечте адекватне перенесення кисню.
• Збільшення ризику контамінації: Це може бути пов'язано з неадекватними процедурами стерилізації або порушеннями асептичної техніки. Перегляньте протоколи стерилізації, покращіть фільтрацію повітря та впровадьте суворіші асептичні процедури.
• Надмірне піноутворення: Це може бути пов'язано зі змінами у складі середовища або фізіології клітин. Оптимізуйте додавання піногасника або встановіть механічний піноломок.
• Зміни морфології клітин: Це може бути пов'язано зі змінами зсувного напруження або градієнтів поживних речовин. Оптимізуйте дизайн імпелера, швидкість перемішування та стратегії підживлення.
• Нестабільність продукту: Це може бути пов'язано зі змінами pH, температури або наявністю руйнівних ферментів. Оптимізуйте параметри процесу та додайте стабілізатори в середовище.

Майбутні тенденції у масштабуванні ферментації

Сфера ферментації постійно розвивається. Деякі з ключових тенденцій, що формують майбутнє масштабування ферментації, включають:

• Безперервна ферментація: Безперервна ферментація пропонує кілька переваг над періодичною ферментацією, включаючи вищу продуктивність, нижчі експлуатаційні витрати та більш стабільну якість продукту.
• Одноразові біореактори: Одноразові біореактори усувають необхідність у чищенні та стерилізації, зменшуючи ризик контамінації та спрощуючи операції.
• Розширений контроль процесів: Розширені методи контролю процесів, такі як модельне предиктивне керування (MPC) та машинне навчання, використовуються для оптимізації процесів ферментації в реальному часі.
• Синтетична біологія: Синтетична біологія використовується для створення мікроорганізмів з покращеними метаболічними можливостями та продуктивністю.
• Мікробні спільноти: Використання мікробних спільнот та консорціумів може відкрити нові метаболічні шляхи та покращити ефективність біопроцесів.

Висновок

Масштабування комерційних процесів ферментації є складним, але важливим кроком у виведенні біопродуктів на ринок. Ретельно враховуючи ключові фактори, обговорені в цьому посібнику, включаючи дизайн біореактора, оптимізацію процесу, моніторинг та контроль, забезпечення стерильності та контроль піноутворення, компанії можуть успішно масштабувати свої процеси ферментації та досягати стабільної якості продукту та продуктивності. Використання нових технологій та методологій, таких як QbD, CFD, моделі зменшеного масштабу та розширений контроль процесів, ще більше підвищить ефективність та надійність комерційних ферментаційних операцій у всьому світі.