Масштабування ферментації: Комплексний посібник для глобального біотехнологічного прогресу

Ферментація — метаболічний процес, що перетворює цукри на кислоти, гази або спирт — є наріжним каменем різноманітних галузей, включаючи харчову промисловість, фармацевтику, виробництво біопалива та промислових ферментів. Масштабування процесів ферментації, тобто перехід від лабораторного до промислового виробництва, створює значні виклики та вимагає глибокого розуміння принципів інженерії біопроцесів. Цей посібник пропонує комплексний огляд масштабування ферментації, охоплюючи ключові концепції, проблеми, технології та стратегії для успішної оптимізації біопроцесів у різних галузях промисловості по всьому світу.

Чому масштабування ферментації є важливим?

Здатність ефективно масштабувати процеси ферментації є вирішальною для комерціалізації біотехнологічних інновацій. Хоча в лабораторних умовах можна досягти багатообіцяючих результатів, перенесення цих результатів на великомасштабне виробництво вимагає ретельного розгляду різноманітних факторів, зокрема:

• Підтримка продуктивності процесу: Забезпечення того, щоб бажаний вихід продукту, якість та продуктивність зберігалися при збільшенні масштабу.
• Економічна ефективність: Оптимізація процесу для мінімізації виробничих витрат та максимізації прибутковості.
• Дотримання нормативних вимог: Відповідність суворим регуляторним вимогам щодо безпеки та ефективності продукції на різних світових ринках.
• Задоволення ринкового попиту: Виробництво достатньої кількості продукту для задоволення ринкового попиту.

Успішне подолання складнощів масштабування ферментації є важливим для компаній, які прагнуть комерціалізувати свої біотехнологічні продукти та отримати конкурентну перевагу на світовому ринку. Наприклад, фармацевтична компанія, що розробляє новий антибіотик за допомогою мікробної ферментації, повинна переконатися, що процес ферментації можна масштабувати для виробництва препарату в достатній кількості, щоб задовольнити потреби пацієнтів у всьому світі. Аналогічно, компанія з виробництва біопалива, що прагне виробляти етанол з лігноцелюлозної біомаси, повинна оптимізувати процес ферментації для великомасштабного виробництва, щоб зробити біопаливо життєздатною альтернативою викопному паливу.

Ключові принципи масштабування ферментації

Успішне масштабування ферментації ґрунтується на кількох фундаментальних принципах інженерії біопроцесів. Розуміння та застосування цих принципів є критично важливим для досягнення оптимальної продуктивності процесу в промислових масштабах.

1. Підтримка постійного коефіцієнта об'ємного масопереносу (kLa)

Перенос кисню часто є обмежуючим фактором в аеробних процесах ферментації. Коефіцієнт об'ємного масопереносу (kLa) є ключовим параметром, що описує швидкість, з якою кисень переноситься з газової фази в рідку фазу в біореакторі. Підтримка постійного kLa під час масштабування є важливою для забезпечення того, щоб клітини отримували достатньо кисню для росту та утворення продукту. Цього можна досягти, регулюючи такі параметри, як швидкість перемішування, швидкість аерації та геометрія біореактора.

Наприклад, при виробництві лимонної кислоти за допомогою Aspergillus niger, обмеження кисню може значно знизити вихід лимонної кислоти. Підтримка достатнього kLa протягом усього процесу ферментації є критично важливою для максимізації виробництва лимонної кислоти. Для покращення переносу кисню можна застосовувати різні стратегії, такі як використання збагаченого киснем повітря або оптимізація конструкції імпелера.

2. Підтримка постійного часу перемішування

Ефективне перемішування є вирішальним для забезпечення гомогенності в біореакторі, запобігання обмеженням по субстрату або поживним речовинам та розсіювання тепла. Підтримка постійного часу перемішування під час масштабування є важливою для забезпечення того, щоб клітини перебували в однорідному середовищі, а градієнти поживних речовин, pH та температури були мінімізовані. На час перемішування можуть впливати такі фактори, як конструкція імпелера, швидкість обертання імпелера та геометрія біореактора.

Розглянемо виробництво рекомбінантних білків у культурі клітин ссавців. Клітини ссавців чутливі до зсуву, і надмірне перемішування може пошкодити клітини та знизити вихід білка. Однак недостатнє перемішування може призвести до обмеження поживних речовин та злипання клітин. Оптимізація часу перемішування для збалансування цих конкуруючих факторів є вирішальною для успішного масштабування.

3. Підтримка постійної швидкості зсуву

Швидкість зсуву, тобто швидкість, з якою сусідні шари рідини рухаються відносно один одного, може мати значний вплив на життєздатність клітин та якість продукту, особливо для чутливих до зсуву клітин, таких як клітини ссавців та рослинні клітини. Підтримка постійної швидкості зсуву під час масштабування є важливою для мінімізації пошкодження клітин та забезпечення стабільної якості продукту. Швидкість зсуву можна контролювати, регулюючи такі параметри, як швидкість обертання та конструкція імпелера.

Наприклад, при виробництві моноклональних антитіл у клітинах CHO, надмірне напруження зсуву може призвести до лізису клітин та вивільнення внутрішньоклітинних протеаз, які можуть руйнувати антитіла. Використання імпелерів з низьким зсувом та оптимізація швидкості перемішування можуть допомогти мінімізувати напруження зсуву та покращити виробництво антитіл.

4. Підтримка постійної питомої потужності (P/V)

Питома потужність (P/V) — це міра енергії, що вводиться в біореактор для перемішування та аерації. Підтримка постійної P/V під час масштабування може допомогти забезпечити, щоб характеристики перемішування та переносу кисню біореактора були схожими на різних масштабах. Однак важливо зазначити, що P/V не є єдиним фактором, що впливає на перемішування та перенос кисню, і слід також враховувати інші параметри, такі як конструкція імпелера та геометрія біореактора.

У багатьох бактеріальних ферментаціях вища P/V може бути прийнятною через більш стійку природу бактеріальних клітин порівняно з клітинами ссавців. Проте, навіть у бактеріальних ферментаціях надмірна P/V може призвести до збільшення споживання енергії та, в деяких випадках, до пошкодження клітин. Тому оптимізація P/V у поєднанні з іншими параметрами є вирішальною.

5. Геометрична подібність

Підтримка геометричної подібності під час масштабування означає, що співвідношення розмірів біореактора (наприклад, діаметр, висота, діаметр імпелера) залишаються постійними. Це може допомогти забезпечити, щоб схеми потоків та характеристики перемішування біореактора були схожими на різних масштабах. Однак часто неможливо підтримувати ідеальну геометричну подібність через практичні обмеження, такі як вартість та обмеження простору. Більше того, ідеальна геометрична подібність не гарантує ідентичної продуктивності, оскільки гідродинаміка не визначається виключно геометрією.

Наприклад, геометрично подібні біореактори можуть мати різні співвідношення площі поверхні до об'єму, що може впливати на швидкість теплопередачі та випаровування. Моделювання за допомогою обчислювальної гідродинаміки (CFD) можна використовувати для оцінки впливу відхилень від геометричної подібності на продуктивність біореактора.

Виклики при масштабуванні ферментації

Масштабування процесів ферментації створює численні виклики, що вимагають ретельного розгляду різноманітних факторів, які можуть вплинути на продуктивність процесу.

1. Обмеження з переносу кисню

Зі збільшенням масштабу біореактора стає складніше підтримувати достатній перенос кисню до клітин. Це пов'язано з тим, що співвідношення площі поверхні до об'єму зменшується, а дифузійний шлях для кисню збільшується. Обмеження кисню може призвести до зниження росту клітин, утворення продукту та навіть загибелі клітин.

Рішення:

• Збільшити швидкість аерації.
• Збільшити швидкість перемішування.
• Використовувати збагачене киснем повітря або чистий кисень.
• Оптимізувати конструкцію імпелера.
• Використовувати біореактор з більшим співвідношенням площі поверхні до об'єму.
• Впроваджувати стратегії, такі як використання мікробульбашок або мембранної аерації.

2. Відведення тепла

Процеси ферментації генерують тепло внаслідок метаболічної активності та перемішування. Зі збільшенням масштабу біореактора стає складніше відводити це тепло, що може призвести до підвищення температури та зниження росту клітин та утворення продукту. Підтримка оптимальної температури є вирішальною для активності ферментів та загального здоров'я клітин.

Рішення:

• Використовувати біореактор з охолоджуючою сорочкою або внутрішніми охолоджуючими змійовиками.
• Збільшити швидкість потоку охолоджувача.
• Використовувати більш ефективну систему охолодження.
• Оптимізувати процес ферментації для зменшення теплоутворення.
• Розглянути можливість випаровувального охолодження, якщо це доцільно (і якщо втрата летких продуктів не є проблемою).

3. Неоднорідність перемішування

Зі збільшенням масштабу біореактора стає складніше підтримувати рівномірне перемішування по всьому об'єму. Це може призвести до градієнтів поживних речовин, pH та температури, що може негативно вплинути на ріст клітин та утворення продукту. Мертві зони або погано перемішані регіони також можуть сприяти накопиченню токсичних побічних продуктів.

Рішення:

• Оптимізувати конструкцію імпелера.
• Збільшити швидкість перемішування.
• Використовувати кілька імпелерів.
• Оптимізувати геометрію біореактора.
• Застосовувати моделювання CFD для розуміння та оптимізації схем перемішування.

4. Контроль pH

Підтримка оптимального pH є вирішальною для росту клітин та утворення продукту. Зі збільшенням масштабу біореактора стає складніше підтримувати рівномірний pH по всьому об'єму. Це може призвести до градієнтів pH, що може негативно вплинути на ріст клітин та утворення продукту. Метаболічні побічні продукти можуть значно змінювати pH, вимагаючи жорсткого контролю.

Рішення:

• Використовувати систему контролю pH з додаванням кислоти та лугу.
• Оптимізувати розташування pH-зонда та точок додавання кислоти/лугу.
• Використовувати буфер для підтримки стабільного pH.
• Розглянути можливість використання онлайн-системи моніторингу та контролю pH.

5. Контроль піни

Утворення піни є поширеною проблемою в процесах ферментації, особливо тих, що включають білки або поверхнево-активні речовини. Піна може призвести до зменшення робочого об'єму, забруднення та засмічення датчиків і фільтрів. Вона також перешкоджає переносу кисню.

Рішення:

• Додавати піногасники.
• Оптимізувати швидкість перемішування та аерації.
• Використовувати механічний піногасник.
• Розглянути можливість використання датчика піни для автоматичного додавання піногасників.

6. Зміни в морфології або фізіології

Клітини можуть демонструвати змінену морфологію або фізіологію при збільшенні масштабу. Напруження зсуву або інші зміни в середовищі біореактора можуть змусити клітини виробляти різні білки або мати різні темпи росту. Ці зміни можуть вплинути на вихід та якість продукту. Це особливо поширено в нитчастих організмах або агрегованих культурах клітин.

Рішення:

• Ретельно контролювати морфологію та фізіологію клітин під час масштабування.
• Регулювати параметри ферментації (наприклад, температуру, pH, рівні поживних речовин) для підтримки оптимального росту клітин та утворення продукту.
• Розглянути можливість використання посівної лінії для поступової адаптації клітин до середовища більшого масштабу.
• Застосовувати процесно-аналітичну технологію (PAT) для моніторингу критичних параметрів процесу в режимі реального часу.

7. Підтримка стерильності

Підтримка стерильності є вирішальною для запобігання забрудненню та забезпечення якості продукту. Зі збільшенням масштабу біореактора стає складніше підтримувати стерильність через збільшену площу поверхні та збільшену кількість з'єднань і точок відбору проб.

Рішення:

• Використовувати валідовані процедури стерилізації для всього обладнання та середовищ.
• Впроваджувати суворі асептичні методи під час роботи.
• Використовувати стерильні фільтри для потоків повітря та газів.
• Регулярно контролювати біореактор на наявність забруднення.
• Забезпечити належну герметизацію всіх з'єднань та портів.

Технології для масштабування ферментації

Для допомоги в масштабуванні та оптимізації ферментації доступно кілька технологій. Ці технології можуть допомогти подолати виклики, пов'язані з масштабуванням процесів ферментації, та покращити продуктивність процесу.

1. Обчислювальна гідродинаміка (CFD)

CFD є потужним інструментом для моделювання потоку рідини, теплопередачі та масопереносу в біореакторах. CFD можна використовувати для оптимізації конструкції біореактора, прогнозування схем перемішування та виявлення мертвих зон. Моделювання CFD може допомогти передбачити умови на більших масштабах на основі експериментів малого масштабу, зменшуючи кількість дорогих пілотних запусків.

Приклад: CFD можна використовувати для оптимізації конструкції та розміщення імпелера у великомасштабному біореакторі для забезпечення рівномірного перемішування та переносу кисню. Він також може виявити зони з високим напруженням зсуву, дозволяючи інженерам коригувати конструкцію для мінімізації пошкодження клітин.

2. Процесно-аналітична технологія (PAT)

PAT — це система для проектування, аналізу та контролю виробництва шляхом своєчасних вимірювань (тобто під час обробки) критичних атрибутів якості та продуктивності сировини, проміжних матеріалів та процесів з метою забезпечення якості кінцевого продукту. Інструменти PAT включають датчики для моніторингу pH, температури, розчиненого кисню, щільності клітин та рівнів поживних речовин. Отримання даних у реальному часі дозволяє негайно вносити корективи в процес ферментації, що призводить до підвищення ефективності та відтворюваності.

Приклад: Використання онлайн-спектрометра ближнього інфрачервоного діапазону (NIR) для моніторингу рівня глюкози в ферментаційному бульйоні дозволяє в реальному часі коригувати швидкість подачі, запобігаючи обмеженню або надлишку глюкози, що може негативно вплинути на вихід продукту.

3. Статистичне планування експериментів (DoE)

DoE — це систематичний підхід до планування та проведення експериментів для визначення оптимальних робочих умов для процесу. DoE можна використовувати для оптимізації параметрів ферментації, таких як температура, pH, рівні поживних речовин та швидкість аерації. DoE є набагато ефективнішим підходом, ніж традиційне експериментування "один фактор за раз".

Приклад: Використання DoE для оптимізації концентрацій різних поживних речовин у ферментаційному середовищі може значно покращити вихід продукту. Статистичний підхід дозволяє виявити взаємодії між поживними речовинами, які можуть бути неочевидними при традиційному експериментуванні.

4. Передові конструкції біореакторів

Для покращення продуктивності процесу було розроблено кілька передових конструкцій біореакторів. До них належать:

• Ерліфтні біореактори: Ці біореактори використовують повітря для забезпечення перемішування та переносу кисню. Вони особливо корисні для чутливих до зсуву клітин.
• Мембранні біореактори: Ці біореактори використовують мембрани для відділення клітин від ферментаційного бульйону, що дозволяє досягти високої щільності клітин та безперервного видалення продукту.
• Хвильові біореактори: Ці біореактори використовують гойдаючий рух для забезпечення перемішування та аерації. Вони особливо корисні для застосувань у клітинних культурах.
• Одноразові біореактори: Ці біореактори є попередньо стерилізованими та одноразовими, що усуває потребу в очищенні та стерилізації та знижує ризик забруднення.

Приклад: Одноразові біореактори все частіше використовуються у біофармацевтичній промисловості для виробництва моноклональних антитіл. Ці біореактори пропонують кілька переваг, включаючи зменшення капітальних інвестицій, швидші цикли виробництва та менший ризик забруднення.

5. Моделі зменшеного масштабу (Scale-Down Models)

Моделі зменшеного масштабу — це маломасштабні біореактори, розроблені для імітації умов у великомасштабному біореакторі. Моделі зменшеного масштабу можна використовувати для вивчення впливу різних параметрів процесу на ріст клітин та утворення продукту без необхідності проводити експерименти у великомасштабному біореакторі. Це економить час та ресурси.

Приклад: Модель зменшеного масштабу можна використовувати для симуляції обмежень переносу кисню у великомасштабному біореакторі. Вивчаючи вплив обмеження кисню на ріст клітин та утворення продукту в моделі зменшеного масштабу, інженери можуть розробити стратегії для подолання цих обмежень у великомасштабному біореакторі.

Стратегії для успішного масштабування ферментації

Успішне масштабування ферментації вимагає добре спланованої та реалізованої стратегії, яка враховує виклики та використовує доступні технології.

1. Глибоке розуміння процесу

Глибоке розуміння процесу ферментації є важливим для успішного масштабування. Це включає розуміння задіяних метаболічних шляхів, оптимальних умов росту для клітин та критичних параметрів процесу, що впливають на вихід та якість продукту. Розуміння потенційних інгібуючих факторів також є критично важливим. Міцна основа, побудована на добре охарактеризованих експериментах малого масштабу, є необхідною.

2. Розробка надійної посівної лінії

Надійна посівна лінія є вирішальною для забезпечення того, щоб клітини були здоровими та активно росли при перенесенні у великомасштабний біореактор. Посівна лінія повинна бути розроблена для поступової адаптації клітин до середовища більшого масштабу. Це часто включає початок з невеликого інокуляту в колбі та поступове збільшення об'єму інокуляту через серію прогресивно більших біореакторів.

3. Впровадження підходу, відповідного фазі

Підхід, відповідний фазі, означає, що рівень строгості та документації повинен відповідати етапу розробки. Ранній етап розробки процесу може зосереджуватися на визначенні оптимальних параметрів ферментації, тоді як пізній етап розробки процесу повинен зосереджуватися на оптимізації та валідації процесу для забезпечення стабільної якості та відтворюваності продукту.

4. Проведення пілотних досліджень

Пілотні дослідження є важливим кроком у процесі масштабування. Пілотні дослідження дозволяють протестувати процес ферментації в біореакторі, який за розміром ближчий до великомасштабного біореактора. Це дозволяє виявити потенційні проблеми та оптимізувати процес перед переходом до повномасштабного виробництва. Пілотні дослідження можуть виявити проблеми з перемішуванням, теплопередачею або контролем pH, які не були очевидними на меншому масштабі.

5. Моніторинг критичних параметрів процесу

Безперервний моніторинг критичних параметрів процесу (КПП) є важливим для забезпечення стабільної якості та відтворюваності продукту. КПП включають температуру, pH, розчинений кисень, щільність клітин та рівні поживних речовин. Моніторинг у реальному часі дозволяє негайно вносити корективи в процес ферментації, запобігаючи відхиленням від оптимальних робочих умов.

6. Впровадження стратегій контролю процесу

Стратегії контролю процесу є важливими для підтримки процесу ферментації в межах бажаного робочого діапазону. Це включає впровадження контурів зворотного зв'язку для автоматичного регулювання таких параметрів, як температура, pH та розчинений кисень. Передові стратегії контролю, такі як модельне предиктивне керування (MPC), можуть бути використані для оптимізації процесу ферментації в режимі реального часу.

7. Розробка ретельного протоколу очищення та стерилізації

Ретельний протокол очищення та стерилізації є важливим для запобігання забрудненню та забезпечення якості продукту. Протокол повинен містити детальні процедури для очищення та стерилізації всього обладнання та середовищ. Ефективність протоколу очищення та стерилізації повинна бути валідована, щоб переконатися, що він здатний видалити всі забруднювачі.

8. Документація та простежуваність

Детальна документація є вирішальною для демонстрації того, що процес ферментації добре контролюється і що продукт відповідає всім вимогам якості. Це включає документування всіх параметрів процесу, сировини та аналітичних результатів. Повинен вестися повний аудиторський слід для забезпечення простежуваності всіх даних.

Глобальні приклади масштабування ферментації

Вивчення успішних історій масштабування ферментації з усього світу пропонує цінні ідеї та вивчені уроки.

1. Виробництво інсуліну в Данії

Novo Nordisk, данська фармацевтична компанія, є світовим лідером у виробництві інсуліну. Компанія успішно масштабувала свої процеси ферментації для виробництва рекомбінантного інсуліну в Saccharomyces cerevisiae. Ключем до їхнього успіху стало впровадження передових стратегій контролю процесу та використання одноразових біореакторів. Вони також застосовують передові методи подальшої обробки для очищення інсуліну, щоб відповідати суворим регуляторним вимогам у всьому світі.

2. Виробництво біопалива в Бразилії

Бразилія є світовим лідером у виробництві етанолу з цукрової тростини. Бразильські компанії розробили високоефективні процеси ферментації для виробництва етанолу, який використовується як біопаливо. Масштабування цих процесів включало оптимізацію штамів дріжджів, що використовуються для ферментації, підвищення ефективності процесу ферментації та розробку надійних методів подальшої обробки. Зазвичай застосовується безперервна ферментація.

3. Виробництво антибіотиків в Індії

Індія є великим виробником антибіотиків. Індійські фармацевтичні компанії успішно масштабували свої процеси ферментації для виробництва різних антибіотиків, включаючи пеніцилін та цефалоспорини. Це включало оптимізацію умов ферментації, підвищення ефективності процесу ферментації та розробку надійних методів подальшої обробки. Вони також зосередилися на економічно ефективних стратегіях виробництва, щоб конкурувати на світовому ринку.

4. Виробництво промислових ферментів у Китаї

Китай є значним виробником промислових ферментів. Китайські компанії масштабували свої процеси ферментації для виробництва різних ферментів, включаючи амілази, протеази та ліпази. Ці ферменти використовуються в широкому спектрі галузей, включаючи харчову промисловість, текстиль та миючі засоби. Ефективна великомасштабна ферментація з використанням генетично модифікованих організмів (ГМО) є звичайною практикою. Виклики включають роботу з різноманітністю сировини та підтримання контролю якості.

Майбутнє масштабування ферментації

Сфера масштабування ферментації постійно розвивається, розробляються нові технології та стратегії для покращення продуктивності процесу та зниження витрат. Деякі з ключових тенденцій у масштабуванні ферментації включають:

• Збільшене використання автоматизації та робототехніки: Автоматизація та робототехніка можуть допомогти покращити ефективність та відтворюваність процесів ферментації.
• Розробка більш ефективних конструкцій біореакторів: Розробляються нові конструкції біореакторів для покращення перемішування, переносу кисню та теплопередачі.
• Збільшене використання процесно-аналітичної технології (PAT): PAT може допомогти контролювати критичні параметри процесу в режимі реального часу, дозволяючи негайно вносити корективи в процес ферментації.
• Інтеграція аналітики даних та штучного інтелекту (ШІ): Аналітика даних та ШІ можуть бути використані для оптимізації процесів ферментації та прогнозування продуктивності процесу.
• Акцент на сталому розвитку: Компанії все більше зосереджуються на розробці сталих процесів ферментації, які мінімізують відходи та споживання енергії.

Висновок

Масштабування ферментації — це складний і відповідальний процес, але він є важливим для комерціалізації біотехнологічних інновацій. Розуміючи ключові принципи масштабування ферментації, вирішуючи проблеми, використовуючи доступні технології та впроваджуючи добре сплановану стратегію, компанії можуть успішно масштабувати свої процеси ферментації та отримати конкурентну перевагу на світовому ринку. Постійні інновації та фокус на сталому розвитку будуть вирішальними для майбутнього технології ферментації у всьому світі.