Povečanje obsega: Celovit vodnik po komercialni fermentaciji

Fermentacija je temelj številnih industrij, od prehrambene in pijačarske do farmacevtske in industrije biogoriv. Medtem ko je uspešna fermentacija v laboratorijskem merilu pomemben dosežek, prenos tega uspeha v komercialno proizvodnjo zahteva skrbno načrtovanje, izvedbo in optimizacijo. Ta vodnik ponuja celovit pregled ključnih dejavnikov in najboljših praks za povečanje obsega komercialnih fermentacijskih procesov.

Zakaj je povečanje obsega fermentacije izziv?

Povečanje obsega fermentacijskega procesa ni zgolj povečanje volumna. Več dejavnikov, ki jih je na majhnem merilu enostavno nadzorovati, postane bistveno bolj zapletenih, ko se proces povečuje. Ti vključujejo:

Prenos toplote: Ohranjanje optimalne temperature je ključno za rast mikrobov in nastanek produkta. Večji bioreaktorji imajo manjše razmerje med površino in volumnom, zaradi česar je odvajanje toplote bolj zahtevno. Neustrezno hlajenje lahko privede do pregrevanja in odmiranja celic, medtem ko lahko prekomerno hlajenje upočasni proces fermentacije.
Prenos snovi: Prenos kisika je pogosto omejujoč dejavnik pri aerobnih fermentacijah. Ko se gostota kulture povečuje, se poveča tudi potreba po kisiku. Zagotavljanje zadostne oskrbe s kisikom po celotnem bioreaktorju postane na večjih merilih vse težje. Mešanje, vpihovanje zraka in zasnova reaktorja igrajo ključno vlogo pri učinkovitosti prenosa kisika.
Mešanje: Učinkovito mešanje je bistveno za ohranjanje homogenosti, porazdelitev hranil in odstranjevanje presnovnih stranskih produktov. Slabo mešanje lahko povzroči gradiente v pH, temperaturi in koncentraciji hranil, kar lahko negativno vpliva na rast celic in nastanek produkta. Tip in konfiguracijo mešal, zasnovo pregrad in hitrost mešanja je treba skrbno pretehtati.
Strižna napetost: Prekomerna strižna napetost, ki jo povzročajo mešala, lahko poškoduje celice, zlasti tiste, ki so občutljive na strižne sile. Optimizacija zasnove mešal in hitrosti mešanja je ključna za zmanjšanje strižne napetosti ob ohranjanju ustreznega mešanja. Nekatere celice (npr. filamentozne glive) so bolj dovzetne za poškodbe zaradi strižnih sil kot druge.
Sterilnost: Ohranjanje sterilnosti je pri fermentacijskih procesih najpomembnejše. Tveganje kontaminacije se povečuje z velikostjo in kompleksnostjo bioreaktorja. Robustni postopki sterilizacije, aseptične tehnike in zaprti sistemi so bistveni za preprečevanje kontaminacije in zagotavljanje kakovosti produkta.
Nadzor pH: Ohranjanje optimalnega območja pH je ključno za aktivnost encimov in preživetje celic. Med potekom fermentacije lahko nastajanje kislin ali baz povzroči znatna nihanja pH. Natančen nadzor pH zahteva sofisticirane sisteme za spremljanje in nadzor.
Spremljanje in nadzor procesa: Učinkovito spremljanje in nadzor kritičnih procesnih parametrov (npr. temperatura, pH, raztopljen kisik, raven hranil) sta ključna za dosledno delovanje in kakovost produkta. Spremljanje v realnem času in avtomatizirani nadzorni sistemi so bistveni za fermentacije velikega obsega.
Presnovni premiki, odvisni od obsega: Celice se lahko v velikih fermentorjih obnašajo drugače kot v kulturah majhnega obsega. Dejavniki, kot so razpoložljivost kisika, strižna napetost in gradienti hranil, lahko spremenijo presnovne poti ter vplivajo na izkoristek in kakovost produkta. Te premike je treba med povečanjem obsega skrbno preučiti in obravnavati.

Stopnje povečanja obsega fermentacije

Proces povečanja obsega običajno vključuje več stopenj, vsaka s svojimi cilji in izzivi:

1. Razvoj matične kulture

Matična kultura služi kot inokulum za produkcijski fermentor. Ključno je razviti matično kulturo, ki je zdrava, aktivno rastoča in brez kontaminacije. To običajno vključuje več stopenj rasti, začenši z zamrznjeno shranjeno kulturo in nadaljevanjem preko stresalk, majhnih bioreaktorjev in končno do fermentorja za matično kulturo. Matična kultura mora biti fiziološko podobna celicam, ki jih želimo v produkcijskem fermentorju.

Primer: Farmacevtsko podjetje, ki razvija nov antibiotik, bi lahko začelo z zamrznjeno zalogo mikroorganizma, ki proizvaja antibiotik. To zalogo se oživi v stresalki, nato prenese v majhen (npr. 2L) bioreaktor. Biomasa iz tega bioreaktorja nato inokulira večji (npr. 50L) fermentor za matično kulturo, ki zagotovi inokulum za produkcijski fermentor.

2. Pilotna fermentacija

Pilotna fermentacija premosti vrzel med laboratorijem in industrijsko proizvodnjo. Omogoča testiranje in optimizacijo fermentacijskega procesa v pogojih, ki bolj spominjajo na polno proizvodno okolje. Pilotne študije pomagajo identificirati potencialne težave pri povečanju obsega in izpopolniti delovne parametre. Ti poskusi običajno vključujejo bioreaktorje s prostornino od 50L do 500L.

Primer: Podjetje za biogoriva bi lahko uporabilo 100-litrski bioreaktor za oceno delovanja novega gensko spremenjenega seva kvasovk za proizvodnjo etanola. Optimizirali bi parametre, kot so temperatura, pH in hitrosti dovajanja hranil, da bi maksimizirali izkoristek in produktivnost etanola.

3. Produkcijska fermentacija

Zadnja stopnja je produkcijska fermentacija, kjer se produkt proizvaja v velikih količinah za komercialno prodajo. Produkcijski bioreaktorji imajo lahko prostornino od nekaj tisoč do več sto tisoč litrov. Ohranjanje doslednega delovanja in kakovosti produkta na tem merilu zahteva skrbno pozornost do podrobnosti in robustne sisteme za nadzor procesov.

Primer: Pivovarna bi lahko za komercialno proizvodnjo piva uporabila 10.000-litrski fermentor. Skrbno bi spremljali temperaturo, pH in raven raztopljenega kisika, da bi zagotovili dosleden okus in kakovost.

Ključni dejavniki pri povečanju obsega fermentacije

1. Zasnova bioreaktorja

Bioreaktor je srce fermentacijskega procesa. Izbira prave zasnove bioreaktorja je ključna za uspešno povečanje obsega. Ključni dejavniki vključujejo:

Tip bioreaktorja: Različni tipi bioreaktorjev so primerni za različne aplikacije. Mešalni reaktorji so najpogostejši tip, vendar obstajajo tudi druge možnosti, kot so zračno-dvižni reaktorji, reaktorji z mehurčastim stolpcem in reaktorji s pakirano posteljo. Izbira je odvisna od specifičnih zahtev fermentacijskega procesa, kot so tip mikroorganizma, potreba po kisiku in občutljivost na strižne sile.
Sistem za mešanje: Sistem za mešanje mora zagotoviti ustrezno mešanje za homogenost, porazdelitev hranil in prenos kisika. Pogosti tipi mešal vključujejo Rushtonove turbine, mešala z nagnjenimi lopaticami in ladijske propelerje. Število in konfiguracijo mešal, zasnovo pregrad in hitrost mešanja je treba optimizirati za specifičen bioreaktor in fermentacijski proces.
Sistem za vpihovanje zraka: Sistem za vpihovanje zraka uvaja zrak ali kisik v bioreaktor. Tip in velikost vpihovalnika, pretok plina in sestavo plina je treba skrbno nadzorovati, da se optimizira prenos kisika brez povzročanja prekomernega penjenja ali poškodb celic.
Sistem za prenos toplote: Sistem za prenos toplote mora vzdrževati bioreaktor na optimalni temperaturi za rast celic in nastanek produkta. To običajno vključuje posodo z dvojnim plaščem s kroženjem hladilne ali grelne tekočine. Zmogljivost prenosa toplote mora biti zadostna za odvajanje toplote, ki nastane med fermentacijskim procesom.
Instrumentacija in nadzor: Bioreaktor mora biti opremljen s senzorji in nadzornimi sistemi za spremljanje in uravnavanje kritičnih procesnih parametrov, kot so temperatura, pH, raztopljen kisik in raven hranil. Avtomatizirani nadzorni sistemi so bistveni za ohranjanje doslednega delovanja in kakovosti produkta.

2. Optimizacija procesa

Optimizacija procesa vključuje identifikacijo in optimizacijo ključnih procesnih parametrov, ki vplivajo na rast celic, nastanek produkta in kakovost produkta. To običajno vključuje kombinacijo eksperimentalnih študij in matematičnega modeliranja.

Optimizacija gojišča: Fermentacijsko gojišče mora zagotoviti vsa hranila, potrebna za rast celic in nastanek produkta. Optimizacija sestave gojišča lahko znatno izboljša izkoristek in produktivnost. To lahko vključuje spreminjanje koncentracij virov ogljika, virov dušika, vitaminov in mineralov. Statistični eksperimentalni načrti, kot je metoda odzivne površine (RSM), se lahko uporabijo za učinkovito optimizacijo sestave gojišča.
Optimizacija temperature: Optimalna temperatura za rast celic in nastanek produkta je odvisna od specifičnega mikroorganizma. Temperatura lahko vpliva na aktivnost encimov, fluidnost membrane in stabilnost beljakovin. Optimalno temperaturo je treba določiti eksperimentalno.
Optimizacija pH: Optimalno območje pH za rast celic in nastanek produkta je prav tako odvisno od specifičnega mikroorganizma. pH lahko vpliva na aktivnost encimov, prepustnost celične membrane in topnost beljakovin. Natančen nadzor pH je bistven za optimalno delovanje fermentacije.
Optimizacija raztopljenega kisika: Ohranjanje ustrezne ravni raztopljenega kisika je ključno za aerobne fermentacije. Optimalna raven raztopljenega kisika je odvisna od potrebe mikroorganizma po kisiku in zmogljivosti prenosa kisika v bioreaktorju. Raven raztopljenega kisika je mogoče nadzorovati s prilagajanjem hitrosti mešanja, hitrosti aeracije in obogatitve s kisikom.
Strategije dovajanja: Pri šaržnih fermentacijah z dovajanjem in kontinuiranih fermentacijah je treba hitrost in sestavo dovajanja skrbno optimizirati, da se maksimizira izkoristek in produktivnost. Strategije povratnega nadzora se lahko uporabijo za prilagajanje hitrosti dovajanja na podlagi meritev koncentracije glukoze, pH ali raztopljenega kisika v realnem času.

3. Spremljanje in nadzor

Učinkovito spremljanje in nadzor kritičnih procesnih parametrov sta bistvena za dosledno delovanje in kakovost produkta. To zahteva uporabo ustreznih senzorjev, nadzornih sistemov in tehnik analize podatkov.

Senzorji: Na voljo so različni senzorji za spremljanje kritičnih procesnih parametrov, vključno s temperaturo, pH, raztopljenim kisikom, koncentracijo glukoze, koncentracijo biomase in koncentracijo produkta. Izbira senzorja je odvisna od specifičnega parametra, ki se meri, in zahtev fermentacijskega procesa.
Nadzorni sistemi: Avtomatizirani nadzorni sistemi se uporabljajo za uravnavanje procesnih parametrov na podlagi povratnih informacij s senzorjev. Pogosti nadzorni sistemi vključujejo PID (proporcionalno-integralno-derivativne) regulatorje, ki prilagajajo manipulirane spremenljivke (npr. temperaturo, pH, hitrost mešanja), da ohranijo želene nastavitvene točke.
Analiza podatkov: Podatke, zbrane s senzorji in nadzornimi sistemi, je mogoče analizirati za prepoznavanje trendov, odkrivanje anomalij in optimizacijo delovanja procesa. Tehnike statističnega nadzora procesov (SPC) se lahko uporabijo za spremljanje variabilnosti procesa in prepoznavanje potencialnih težav, preden vplivajo na kakovost produkta.
Procesna analitska tehnologija (PAT): PAT je okvir za načrtovanje, analizo in nadzor proizvodnih procesov s pravočasnimi meritvami kritičnih atributov kakovosti (CQA) in kritičnih procesnih parametrov (CPP). Cilj PAT je izboljšati razumevanje procesa, zmanjšati variabilnost in povečati kakovost produkta.

4. Zagotavljanje sterilnosti

Ohranjanje sterilnosti je pri fermentacijskih procesih ključnega pomena. Kontaminacija lahko privede do kvarjenja produkta, zmanjšanega izkoristka in celo do popolne odpovedi procesa. Izvajanje robustnih postopkov sterilizacije in aseptičnih tehnik je bistveno.

Sterilizacija opreme: Vsa oprema, ki pride v stik s fermentacijsko brozgo, vključno z bioreaktorjem, cevmi in senzorji, mora biti pred uporabo temeljito sterilizirana. Parna sterilizacija je najpogostejša metoda, druge možnosti pa vključujejo avtoklaviranje, filtracijo in kemično sterilizacijo.
Sterilizacija gojišč: Fermentacijsko gojišče je treba prav tako sterilizirati, da se odstranijo vsi kontaminirajoči mikroorganizmi. To se običajno opravi z avtoklaviranjem ali filtrirno sterilizacijo.
Aseptične tehnike: Vse operacije, ki vključujejo odpiranje bioreaktorja ali vnos materialov v fermentacijsko brozgo, je treba izvajati z uporabo aseptičnih tehnik. To vključuje uporabo sterilne opreme, nošenje sterilnih rokavic in delo v čistem okolju.
Filtracija zraka: Zrak, ki vstopa v bioreaktor, je treba filtrirati skozi sterilne filtre, da se odstranijo vsi mikroorganizmi v zraku.
Zaprti sistemi: Uporaba zaprtih sistemov zmanjšuje tveganje kontaminacije. To vključuje povezovanje vse opreme in cevi v zaprto zanko in izogibanje odprtim prenosom materialov.

5. Nadzor penjenja

Tvorba pene je pogosta težava pri fermentacijskih procesih, zlasti tistih, ki vključujejo beljakovine ali površinsko aktivne snovi. Prekomerna pena lahko privede do zmanjšanega prenosa kisika, kontaminacije in izgube produkta. Peno je mogoče nadzorovati z dodajanjem sredstev proti penjenju ali z uporabo mehanskih lomilcev pene.

Sredstva proti penjenju: Sredstva proti penjenju so kemikalije, ki zmanjšujejo površinsko napetost fermentacijske brozge in preprečujejo nastanek pene. Pogosta sredstva proti penjenju vključujejo silikone, rastlinska olja in maščobne kisline. Izbira sredstva proti penjenju je odvisna od specifičnega fermentacijskega procesa in občutljivosti mikroorganizma.
Mehanski lomilci pene: Mehanski lomilci pene uporabljajo vrteče se lopatice ali druge naprave za fizično razbijanje pene. Pogosto se uporabljajo v kombinaciji s sredstvi proti penjenju.

Strategije za uspešno povečanje obsega

1. Pristop QbD (kakovost z načrtovanjem)

QbD je sistematičen pristop k razvoju, ki se začne z vnaprej določenimi cilji in poudarja razumevanje produkta in procesa ter nadzor procesa. Uporaba načel QbD pri povečanju obsega fermentacije pomaga zagotoviti dosledno kakovost in delovanje produkta.

Ključni elementi QbD vključujejo:

Določitev ciljnega profila kakovosti produkta (QTPP): QTPP opisuje želene značilnosti končnega produkta, kot so čistost, moč in stabilnost.
Identifikacija kritičnih atributov kakovosti (CQA): CQA so fizikalne, kemijske, biološke ali mikrobiološke lastnosti, ki jih je treba nadzorovati, da se zagotovi želena kakovost produkta.
Identifikacija kritičnih procesnih parametrov (CPP): CPP so procesni parametri, ki lahko vplivajo na CQA.
Vzpostavitev načrtovalnega prostora: Načrtovalni prostor je večdimenzionalna kombinacija in interakcija vhodnih spremenljivk (npr. CPP) in procesnih parametrov, za katere je bilo dokazano, da zagotavljajo kakovost. Delo znotraj načrtovalnega prostora zagotavlja, da produkt ustreza želenim atributom kakovosti.
Implementacija strategije nadzora: Strategija nadzora opisuje, kako se bodo CPP spremljali in nadzorovali, da se zagotovi, da proces ostane znotraj načrtovalnega prostora in da produkt ustreza želenim atributom kakovosti.

2. Računalniška dinamika tekočin (CFD)

CFD je močno orodje za simulacijo pretoka tekočin, prenosa toplote in prenosa snovi v bioreaktorjih. CFD simulacije se lahko uporabijo za optimizacijo zasnove bioreaktorjev, sistemov za mešanje in sistemov za vpihovanje zraka. Prav tako lahko pomagajo pri odkrivanju potencialnih težav, kot so mrtve cone in žarišča strižne napetosti. CFD lahko zmanjša število dragih in dolgotrajnih pilotnih poskusov, potrebnih za povečanje obsega.

3. Pomanjšani modeli

Pomanjšani modeli so bioreaktorji majhnega obsega, zasnovani tako, da posnemajo pogoje v velikem produkcijskem bioreaktorju. Pomanjšane modele je mogoče uporabiti za preučevanje učinkov različnih procesnih parametrov na rast celic, nastanek produkta in kakovost produkta. Uporabljajo se lahko tudi za odpravljanje težav, ki se pojavijo med povečanjem obsega. Dobro karakterizirani pomanjšani modeli lahko zagotovijo dragocene vpoglede in pospešijo razvojni proces.

4. Modeliranje in simulacija procesov

Modeliranje in simulacijo procesov lahko uporabimo za napovedovanje obnašanja fermentacijskega procesa v različnih merilih in pod različnimi pogoji delovanja. Matematične modele je mogoče razviti na podlagi temeljnih načel prenosa snovi, prenosa toplote in reakcijske kinetike. Te modele je mogoče uporabiti za optimizacijo procesnih parametrov, načrtovanje strategij nadzora in odpravljanje težav. Orodja, kot so MATLAB, gPROMS in Aspen Plus, se lahko uporabljajo za modeliranje in simulacijo procesov.

Dejavniki pri končni obdelavi produkta

Dejavniki pri povečanju obsega presegajo sam fermentacijski proces. Končno obdelavo produkta, ki vključuje ločevanje in čiščenje produkta iz fermentacijske brozge, je treba prav tako povečati. Izbira tehnik končne obdelave produkta je odvisna od narave produkta, njegove koncentracije in želene čistosti. Pogoste tehnike končne obdelave produkta vključujejo:

Ločevanje celic: Odstranjevanje celic iz fermentacijske brozge je pogosto prvi korak pri končni obdelavi. To je mogoče storiti s centrifugiranjem, filtracijo ali mikrofiltracijo.
Razbijanje celic: Če je produkt intracelularen, je treba celice razbiti, da se produkt sprosti. To je mogoče storiti z mehanskimi metodami (npr. homogenizacija, mletje s kroglicami) ali kemičnimi metodami (npr. encimska liza).
Izolacija produkta: Produkt je mogoče izolirati iz fermentacijske brozge z različnimi tehnikami, vključno z obarjanjem, ekstrakcijo in adsorpcijo.
Čiščenje produkta: Produkt se običajno čisti s kromatografskimi tehnikami, kot so afinitetna kromatografija, ionsko-izmenjevalna kromatografija in velikostno-izključitvena kromatografija.
Formulacija produkta: Zadnji korak pri končni obdelavi je formulacija produkta v stabilno in uporabno obliko. To lahko vključuje dodajanje pomožnih snovi, stabilizatorjev in konzervansov.

Globalni primeri uspešnega povečanja obsega fermentacije

Številne industrije po svetu so močno odvisne od uspešnega povečanja obsega fermentacije. Tukaj je nekaj primerov:

Farmacevtska industrija (globalno): Proizvodnja antibiotikov, cepiv in drugih biofarmacevtskih izdelkov temelji na fermentaciji mikroorganizmov ali celičnih kultur v velikem obsegu. Podjetja, kot so Pfizer, Roche in Novartis, upravljajo ogromne fermentacijske obrate po vsem svetu.
Prehrambena industrija in industrija pijač (Evropa, Severna Amerika, Azija): Proizvodnja piva, vina, jogurta, sira in drugih fermentiranih živil in pijač temelji na nadzorovanih fermentacijskih procesih. Podjetja, kot so Anheuser-Busch InBev (Belgija), Danone (Francija) in Kirin Brewery (Japonska), so v mnogih letih izpopolnila povečanje obsega fermentacije.
Industrija biogoriv (Brazilija, ZDA): Proizvodnja etanola iz sladkornega trsa (Brazilija) in koruze (ZDA) vključuje fermentacijo sladkorjev s kvasovkami v velikem obsegu. Podjetja, kot sta Raizen (Brazilija) in Archer Daniels Midland (ZDA), upravljajo obrate za proizvodnjo biogoriv v velikem obsegu.
Industrijska biotehnologija (Danska, Nemčija, Kitajska): Proizvodnja encimov, bioplastike in drugih bioloških izdelkov temelji na fermentaciji gensko spremenjenih mikroorganizmov. Podjetja, kot so Novozymes (Danska), BASF (Nemčija) in Amyris (ZDA), so vodilna na tem področju.

Odpravljanje pogostih težav pri povečanju obsega

Kljub skrbnemu načrtovanju in izvedbi se med povečanjem obsega fermentacije še vedno lahko pojavijo težave. Tukaj je nekaj pogostih težav in možnih rešitev:

Zmanjšan izkoristek produkta: To je lahko posledica sprememb v presnovnih poteh, omejitev hranil ali kopičenja zaviralnih stranskih produktov. Preglejte sestavo gojišča, optimizirajte strategije dovajanja in zagotovite ustrezen prenos kisika.
Povečano tveganje kontaminacije: To je lahko posledica neustreznih postopkov sterilizacije ali kršitev aseptične tehnike. Preglejte protokole sterilizacije, izboljšajte filtracijo zraka in uvedite strožje aseptične postopke.
Prekomerna proizvodnja pene: To je lahko posledica sprememb v sestavi gojišča ali fiziologiji celic. Optimizirajte dodajanje sredstva proti penjenju ali namestite mehanski lomilec pene.
Spremembe v morfologiji celic: To je lahko posledica sprememb v strižni napetosti ali gradientih hranil. Optimizirajte zasnovo mešal, hitrost mešanja in strategije dovajanja.
Nestabilnost produkta: To je lahko posledica sprememb v pH, temperaturi ali prisotnosti razgradnih encimov. Optimizirajte procesne parametre in dodajte stabilizatorje v gojišče.

Prihodnji trendi pri povečanju obsega fermentacije

Področje fermentacije se nenehno razvija. Nekateri ključni trendi, ki oblikujejo prihodnost povečanja obsega fermentacije, vključujejo:

Kontinuirana fermentacija: Kontinuirana fermentacija ponuja več prednosti pred šaržno fermentacijo, vključno z večjo produktivnostjo, nižjimi obratovalnimi stroški in bolj dosledno kakovostjo produkta.
Bioreaktorji za enkratno uporabo: Bioreaktorji za enkratno uporabo odpravljajo potrebo po čiščenju in sterilizaciji, zmanjšujejo tveganje kontaminacije in poenostavljajo delovanje.
Napredni nadzor procesov: Napredne tehnike nadzora procesov, kot sta modelno prediktivno krmiljenje (MPC) in strojno učenje, se uporabljajo za optimizacijo fermentacijskih procesov v realnem času.
Sintetična biologija: Sintetična biologija se uporablja za inženiring mikroorganizmov z izboljšanimi presnovnimi zmožnostmi in produktivnostjo.
Mikrobne združbe: Izkoriščanje mikrobnih združb in konzorcijev lahko odklene nove presnovne poti in izboljša učinkovitost bioprocesov.

Zaključek

Povečanje obsega komercialnih fermentacijskih procesov je zapleten, a nujen korak pri uvajanju bioproduktov na trg. S skrbnim upoštevanjem ključnih dejavnikov, obravnavanih v tem vodniku, vključno z zasnovo bioreaktorjev, optimizacijo procesa, spremljanjem in nadzorom, zagotavljanjem sterilnosti in nadzorom penjenja, lahko podjetja uspešno povečajo obseg svojih fermentacijskih procesov in dosežejo dosledno kakovost in delovanje produkta. Sprejemanje novih tehnologij in metodologij, kot so QbD, CFD, pomanjšani modeli in napredni nadzor procesov, bo dodatno povečalo učinkovitost in robustnost komercialnih fermentacijskih operacij po vsem svetu.