Открывая невидимый мир: полное руководство по идентификации почвенных микробов

Почва, которую мы часто принимаем как должное, представляет собой кипучую экосистему, изобилующую жизнью. Эта жизнь, в значительной степени невидимая невооруженным глазом, состоит из невероятно разнообразного сообщества микроорганизмов – бактерий, архей, грибов, вирусов и простейших. Эти почвенные микробы играют важнейшую роль в различных биогеохимических циклах, стимулировании роста растений и поддержании общего здоровья почвы. Понимание состава и функций этих микробных сообществ необходимо для устойчивого сельского хозяйства, управления окружающей средой и биотехнологических приложений. В этом подробном руководстве представлен обзор методов, используемых для идентификации почвенных микробов, от традиционных техник до передовых подходов.

Зачем идентифицировать почвенные микробы?

Идентификация почвенных микробов — это не просто академическое упражнение; она имеет значительные практические последствия в различных областях:

• Сельское хозяйство: Идентификация полезных микробов (например, азотфиксаторов, фосфатсолюбилизаторов, ризобактерий, стимулирующих рост растений - PGPR) может привести к разработке биоудобрений и биопестицидов, что снижает зависимость от синтетических ресурсов и способствует устойчивому ведению сельского хозяйства. Например, понимание разнообразия видов Rhizobium в регионах Южной Америки, где выращивают бобовые, позволяет выбирать наиболее эффективные штаммы для инокуляции, максимизируя фиксацию азота и урожайность.
• Наука об окружающей среде: Почвенные микробы жизненно важны для разложения загрязнителей, круговорота питательных веществ и связывания углерода. Идентификация микробов, участвующих в этих процессах, помогает в разработке стратегий биоремедиации загрязненных почв и понимании влияния изменения климата на почвенные экосистемы. Анализ структуры микробного сообщества в арктической вечной мерзлоте, например, помогает ученым предсказывать скорость высвобождения метана по мере ее таяния.
• Биотехнология: Почвенные микробы являются богатым источником новых ферментов, антибиотиков и других биологически активных соединений с потенциальным применением в различных отраслях. Идентификация и выделение этих микробов может привести к открытию новых биотехнологических продуктов. Скрининг образцов почвы из тропических лесов Амазонки привел к открытию новых грибов, производящих ферменты с потенциальным применением в производстве биотоплива.
• Оценка здоровья почвы: Состав и активность почвенного микробного сообщества являются индикаторами здоровья почвы. Мониторинг изменений в структуре микробного сообщества может служить ранним предупреждением о деградации почвы или влиянии методов управления. Анализ соотношения грибов и бактерий в сельскохозяйственных почвах может указывать на уровень нарушенности и потенциал круговорота питательных веществ.

Традиционные методы идентификации почвенных микробов

Традиционные методы основаны на культивировании микробов в лаборатории и их идентификации по морфологическим, физиологическим и биохимическим характеристикам. Хотя эти методы относительно недороги и просты, у них есть ограничения, включая невозможность культивирования многих почвенных микробов («великая аномалия чашечного подсчета») и трудоемкость идентификации.

Микроскопия

Микроскопия включает наблюдение за почвенными микробами под микроскопом. Для визуализации различных типов микробов и их клеточных структур могут использоваться различные методы окрашивания, такие как окрашивание по Граму и флуоресцентная микроскопия. Однако одна лишь микроскопия не позволяет идентифицировать микробы до видового уровня. Например, наблюдение за бактериальными клетками под микроскопом после окрашивания по Граму может различить грамположительные и грамотрицательные бактерии, но для точной идентификации необходим дальнейший анализ. В условиях ограниченных ресурсов в странах Африки к югу от Сахары простая световая микроскопия часто используется для оценки наличия и относительной численности грибных гиф в образцах почвы, что дает базовое представление о здоровье почвы.

Культуральные методы

Культуральные методы включают выделение и выращивание микробов на селективных средах. После выделения микробы могут быть идентифицированы по морфологии колоний, биохимическим тестам (например, анализы на ферменты, утилизация источников углерода) и физиологическим характеристикам (например, температура роста, толерантность к pH). Хотя эти методы полезны для выделения и характеристики конкретных микробов, они охватывают лишь малую часть общего микробного разнообразия в почве. Например, культивирование бактерий с рисовых полей в Юго-Восточной Азии может выявить штаммы, способные к фиксации азота, но при этом могут быть упущены многие другие важные микробные виды, участвующие в круговороте питательных веществ.

Пример: Метод серийных разведений с последующим высевом на чашки является распространенной техникой для оценки количества культивируемых бактерий в образце почвы. Образец почвы серийно разводится, и аликвоты каждого разведения высеваются на агаровые чашки. После инкубации подсчитывается количество колоний на каждой чашке, и вычисляется количество бактерий на грамм почвы.

Биохимические тесты

Биохимические тесты используются для определения метаболических способностей выделенных микробов. Эти тесты могут включать анализы на активность ферментов (например, каталазы, оксидазы, уреазы), утилизацию источников углерода и азотный метаболизм. Результаты этих тестов могут быть использованы для идентификации микробов на основе их характерных метаболических профилей. Распространенным примером является использование тест-систем API, которые содержат серию биохимических тестов в миниатюрном формате, что позволяет быстро идентифицировать бактериальные изоляты. Эти тесты широко используются в клинических микробиологических лабораториях по всему миру.

Современные методы идентификации почвенных микробов

Современные методы основаны на молекулярных технологиях для идентификации почвенных микробов без необходимости их культивирования. Эти методы предоставляют более полную и точную картину почвенного микробного сообщества.

Выделение и секвенирование ДНК

Первым шагом в молекулярной идентификации является выделение ДНК из образцов почвы. Выделенная ДНК затем может быть использована в качестве матрицы для ПЦР-амплификации специфических генов, таких как ген 16S рРНК (для бактерий и архей) или регион ITS (для грибов). Амплифицированная ДНК затем секвенируется, и последовательности сравниваются с базами данных известных микробных последовательностей для идентификации микробов, присутствующих в образце почвы. Метагеномное секвенирование, которое включает секвенирование всей ДНК в образце почвы, предоставляет еще более полную картину микробного сообщества, включая информацию о присутствующих функциональных генах. В регионе пампы Южной Америки исследователи используют метагеномику для понимания влияния различных методов обработки почвы на почвенное микробное сообщество и его роль в цикле углерода.

Пример: Секвенирование гена 16S рРНК является широко используемым методом для идентификации бактерий и архей в образцах почвы. Ген 16S рРНК — это высококонсервативный ген, который содержит вариабельные участки, используемые для различения разных видов. Выделенная ДНК амплифицируется с помощью ПЦР-праймеров, нацеленных на ген 16S рРНК, а амплифицированная ДНК секвенируется с использованием технологий секвенирования нового поколения. Затем последовательности сравниваются с базами данных известных последовательностей гена 16S рРНК для идентификации бактерий и архей, присутствующих в образце почвы.

кПЦР и цПЦР

Количественная ПЦР (кПЦР) и цифровая ПЦР (цПЦР) используются для количественной оценки численности конкретных микробов или генов в образцах почвы. Эти методы основаны на амплификации ДНК с помощью ПЦР, но они также включают флуоресцентный краситель или зонд, что позволяет количественно определять амплифицированную ДНК. кПЦР и цПЦР могут использоваться для отслеживания изменений в численности конкретных микробов в ответ на изменения окружающей среды или методы управления. Например, кПЦР можно использовать для мониторинга численности азотфиксирующих бактерий в сельскохозяйственных почвах после применения биоудобрений. На рисовых полях Азии кПЦР используется для мониторинга численности метаногенов и метанотрофов, ключевых участников эмиссии метана из этих экосистем.

Метагеномика

Метагеномика включает секвенирование всей ДНК, присутствующей в образце почвы, что дает полную картину микробного сообщества, включая как типы присутствующих микробов, так и их функциональный потенциал. Метагеномные данные могут быть использованы для выявления новых генов и ферментов, понимания микробных взаимодействий и оценки влияния изменений окружающей среды на почвенный микробиом. Например, метагеномика использовалась для изучения микробных сообществ в экстремальных условиях, таких как пустыни и солончаки, выявляя новые адаптации и метаболические пути. В настоящее время реализуются крупномасштабные метагеномные проекты по характеристике почвенных микробиомов сельскохозяйственных угодий по всему миру с целью определения стратегий по улучшению здоровья почвы и продуктивности сельскохозяйственных культур.

Пример: Дробовое секвенирование полного генома — это метагеномный подход, который включает секвенирование всей ДНК в образце почвы без предварительной амплификации конкретных генов. Полученные последовательности затем собираются в контиги, а контиги аннотируются для идентификации генов и метаболических путей, присутствующих в почвенном микробном сообществе. Этот подход может предоставить исчерпывающую картину функционального потенциала почвенного микробиома.

Метатранскриптомика

Метатранскриптомика включает секвенирование всей РНК, присутствующей в образце почвы, что дает моментальный снимок генов, которые активно экспрессируются микробным сообществом в определенный момент времени. Этот подход может быть использован для идентификации микробов, активно участвующих в конкретных процессах, таких как круговорот питательных веществ или деградация загрязнителей. Например, метатранскриптомика использовалась для изучения реакции почвенного микробиома на засуху, выявляя гены и метаболические пути, которые активируются во время засухи. В тропических лесах Амазонки метатранскриптомика используется для изучения активности грибных сообществ, участвующих в разложении органического вещества.

Протеомика

Протеомика включает идентификацию и количественную оценку белков, присутствующих в образце почвы, что является прямой мерой функциональной активности микробного сообщества. Протеомика может использоваться для идентификации ферментов, активно производимых микробами, и для понимания того, как микробное сообщество реагирует на изменения окружающей среды. Этот подход более сложен, чем методы на основе ДНК, но он обеспечивает более прямое измерение микробной функции. Например, протеомика использовалась для изучения влияния загрязнения тяжелыми металлами на почвенное микробное сообщество, выявляя белки, участвующие в детоксикации тяжелых металлов. Почвенная протеомика все чаще используется в сочетании с метагеномикой и метатранскриптомикой для получения более целостного понимания почвенного микробиома.

Анализ липидов (PLFA и NLFA)

Анализ фосфолипидных жирных кислот (PLFA) и нейтральных липидных жирных кислот (NLFA) — это методы, используемые для характеристики состава микробного сообщества на основе профилей жирных кислот клеточных мембран микроорганизмов. Анализ PLFA предоставляет информацию об активной микробной биомассе, в то время как анализ NLFA дает информацию о запасных липидах микробного сообщества. Эти методы относительно недороги и могут обеспечить быструю оценку структуры микробного сообщества. Например, анализ PLFA использовался для изучения влияния различных методов обработки почвы на почвенное микробное сообщество. Анализ PLFA используется по всему миру для оценки влияния методов землепользования на состав почвенного микробного сообщества.

Новые технологии для идентификации почвенных микробов

Постоянно разрабатываются новые технологии для идентификации почвенных микробов, предлагающие еще большее разрешение и пропускную способность.

Нанопоровое секвенирование

Нанопоровое секвенирование — это технология секвенирования третьего поколения, которая позволяет секвенировать длинные фрагменты ДНК в реальном времени. Эта технология способна революционизировать идентификацию почвенных микробов, позволяя секвенировать целые микробные геномы непосредственно из образцов почвы, без необходимости амплификации или клонирования. Нанопоровое секвенирование также является портативным, что делает его пригодным для полевых исследований. Например, нанопоровое секвенирование использовалось для идентификации фитопатогенов непосредственно из инфицированных тканей растений. Его портативность особенно полезна для исследований в отдаленных местах, где доступ к традиционным лабораторным мощностям ограничен.

Рамановская спектроскопия

Рамановская спектроскопия — это неразрушающий метод, который можно использовать для идентификации микробов на основе их уникальных колебательных спектров. Этот метод не требует подготовки образцов и может использоваться для анализа микробов in situ. Рамановская спектроскопия потенциально может быть использована для быстрого и высокопроизводительного скрининга образцов почвы на наличие специфических микробов. Например, рамановская спектроскопия использовалась для идентификации бактерий в биопленках. Ее исследуют для быстрого анализа здоровья почвы на месте в сельскохозяйственных полях, что потенциально может заменить трудоемкие лабораторные анализы.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — это метод, который можно использовать для подсчета и характеристики отдельных микробных клеток на основе их размера, формы и флуоресценции. Этот метод может применяться для оценки жизнеспособности и активности почвенных микробов, а также для идентификации конкретных микробных популяций. Проточная цитометрия особенно полезна для изучения сложных микробных сообществ. На очистных сооружениях проточная цитометрия используется для мониторинга активности микробных сообществ, ответственных за удаление загрязнителей.

Изотопное зондирование

Изотопное зондирование включает введение стабильных изотопов (например, ¹³C, ¹⁵N) в специфические биомолекулы (например, ДНК, РНК, белки) микробами, которые активно метаболизируют определенный субстрат. Отслеживая судьбу изотопов, исследователи могут идентифицировать микробы, ответственные за конкретные процессы. Например, зондирование стабильными изотопами использовалось для идентификации микробов, ответственных за разложение конкретных загрязнителей в почве. Этот метод особенно ценен для понимания функциональных ролей различных микробов в сложных экосистемах. В сельскохозяйственных системах изотопное зондирование используется для идентификации микробов, ответственных за поглощение азота из различных источников удобрений.

Применение идентификации почвенных микробов

Идентификация почвенных микробов имеет многочисленные применения в различных областях, включая:

• Разработка биоудобрений и биопестицидов: Идентификация полезных микробов может привести к разработке биоудобрений, которые улучшают рост растений, и биопестицидов, которые контролируют вредителей и болезни растений. Например, Bacillus thuringiensis является широко используемым биопестицидом, который производит инсектицидные белки. Идентификация и характеристика новых штаммов B. thuringiensis может привести к разработке более эффективных биопестицидов. Во многих развивающихся странах мелкие фермеры все чаще применяют биоудобрения и биопестициды в качестве устойчивой альтернативы синтетическим ресурсам.
• Биоремедиация загрязненных почв: Идентификация микробов, способных разлагать загрязнители, может привести к разработке стратегий биоремедиации загрязненных почв. Например, Pseudomonas putida — это бактерия, которая может разлагать широкий спектр органических загрязнителей. Идентификация и характеристика новых штаммов P. putida может привести к разработке более эффективных технологий биоремедиации. Биоремедиация используется для очистки загрязненных участков по всему миру, включая промышленные зоны, сельскохозяйственные угодья и военные базы.
• Улучшение здоровья почвы: Понимание состава и функции почвенного микробного сообщества может привести к разработке практик управления, улучшающих здоровье почвы. Например, использование покровных культур и нулевой обработки почвы может увеличить разнообразие и активность почвенного микробного сообщества, что приводит к улучшению плодородия почвы и инфильтрации воды. В Австралии широко применяются практики консервационного земледелия для улучшения здоровья почвы и уменьшения ее эрозии.
• Открытие новых ферментов и биологически активных соединений: Почвенные микробы являются богатым источником новых ферментов и биологически активных соединений с потенциальным применением в различных отраслях. Идентификация и выделение этих микробов может привести к открытию новых биотехнологических продуктов. Например, почвенные микробы проверяются на наличие ферментов, которые можно использовать для производства биотоплива. Фармацевтические компании также активно ищут новые антибиотики и другие лекарства из почвенных микробов.

Проблемы и будущие направления

Несмотря на значительные успехи в идентификации почвенных микробов, остается несколько проблем:

• Сложность почвенного микробиома: Почвенный микробиом невероятно сложен, в нем тысячи различных видов микробов взаимодействуют друг с другом и с окружающей средой. Понимание этих взаимодействий является серьезной задачей.
• Недостаток культивируемых микробов: Многие почвенные микробы не могут быть культивированы в лаборатории, что затрудняет изучение их физиологии и функций.
• Анализ данных: Огромные объемы данных, генерируемых современными технологиями секвенирования, требуют для анализа сложных биоинформатических инструментов и опыта.
• Стандартизация методов: Необходима стандартизация методов идентификации почвенных микробов для обеспечения сопоставимости результатов различных исследований.

Будущие направления исследований включают:

• Разработка новых методов культивирования: Необходимы новые методы культивирования для выделения и изучения многих почвенных микробов, которые в настоящее время не поддаются культивированию.
• Интеграция мультиомиксных данных: Интеграция данных из различных омиксных подходов (например, метагеномики, метатранскриптомики, протеомики) может обеспечить более целостное понимание почвенного микробиома.
• Разработка новых биоинформатических инструментов: Необходимы новые биоинформатические инструменты для анализа больших объемов данных, генерируемых современными технологиями секвенирования.
• Применение искусственного интеллекта и машинного обучения: Искусственный интеллект и машинное обучение могут использоваться для анализа сложных наборов данных и выявления закономерностей в почвенном микробиоме.
• Разработка диагностических инструментов для использования на местах: Разработка быстрых и недорогих диагностических инструментов для оценки здоровья почвы позволит фермерам и землеустроителям принимать обоснованные решения о методах управления почвой.

Заключение

Идентификация почвенных микробов — это быстро развивающаяся область, имеющая значительные последствия для сельского хозяйства, науки об окружающей среде и биотехнологии. Сочетая традиционные и современные методы, исследователи глубже понимают разнообразие, функции и взаимодействия почвенных микробов. Эти знания необходимы для разработки устойчивых решений глобальных проблем, таких как продовольственная безопасность, изменение климата и загрязнение окружающей среды. По мере развития технологий и углубления нашего понимания почвенного микробиома мы можем ожидать еще более захватывающих открытий в ближайшие годы, которые приведут к инновационным приложениям, приносящим пользу как человечеству, так и планете. Понимание невидимого мира под нашими ногами имеет решающее значение для построения устойчивого будущего.