Масштабирование ферментации: всеобъемлющее руководство для глобального биотехнологического прогресса

Ферментация, метаболический процесс, который преобразует сахара в кислоты, газы или спирт, является краеугольным камнем различных отраслей, включая производство продуктов питания и напитков, фармацевтику, биотопливо и промышленные ферменты. Масштабирование процессов ферментации, переход от лабораторного масштаба к промышленному производству, представляет собой значительные проблемы и требует глубокого понимания принципов проектирования биопроцессов. Это руководство предоставляет всеобъемлющий обзор масштабирования ферментации, охватывающий ключевые концепции, проблемы, технологии и стратегии для успешной оптимизации биопроцессов в различных отраслях по всему миру.

Почему важно масштабирование ферментации?

Способность эффективно масштабировать процессы ферментации имеет решающее значение для коммерциализации биотехнологических инноваций. Хотя многообещающие результаты могут быть достигнуты в лабораторном масштабе, перенос этих результатов в крупномасштабное производство требует тщательного рассмотрения различных факторов, включая:

• Поддержание производительности процесса: Обеспечение поддержания желаемого выхода продукта, качества и производительности по мере увеличения масштаба.
• Экономическая эффективность: Оптимизация процесса для минимизации производственных затрат и максимизации прибыльности.
• Соответствие нормативным требованиям: Соблюдение строгих нормативных требований к безопасности и эффективности продукции на различных мировых рынках.
• Удовлетворение рыночного спроса: Производство достаточного количества продукта для удовлетворения рыночного спроса.

Успешное преодоление сложностей масштабирования ферментации необходимо компаниям, стремящимся коммерциализировать свои биотехнологические продукты и получить конкурентное преимущество на мировом рынке. Например, фармацевтическая компания, разрабатывающая новый антибиотик посредством микробной ферментации, должна обеспечить возможность масштабирования процесса ферментации для производства лекарственного средства в количестве, достаточном для удовлетворения потребностей пациентов во всем мире. Аналогичным образом, компания по производству биотоплива, стремящаяся производить этанол из лигноцеллюлозной биомассы, должна оптимизировать процесс ферментации для крупномасштабного производства, чтобы сделать биотопливо жизнеспособной альтернативой ископаемому топливу.

Ключевые принципы масштабирования ферментации

Успешное масштабирование ферментации основывается на нескольких фундаментальных принципах проектирования биопроцессов. Понимание и применение этих принципов имеет решающее значение для достижения оптимальной производительности процесса в промышленном масштабе.

1. Поддержание постоянного объемного коэффициента массопередачи (kLa)

Передача кислорода часто является ограничивающим фактором в аэробных процессах ферментации. Объемный коэффициент массопередачи (kLa) является важным параметром, который описывает скорость, с которой кислород передается из газовой фазы в жидкую фазу в биореакторе. Поддержание постоянного kLa во время масштабирования имеет важное значение для обеспечения того, чтобы клетки получали достаточно кислорода для роста и образования продукта. Это может быть достигнуто путем регулировки таких параметров, как скорость перемешивания, скорость аэрации и геометрия биореактора.

Например, в производстве лимонной кислоты Aspergillus niger ограничение по кислороду может значительно снизить выход лимонной кислоты. Поддержание достаточного kLa на протяжении всего процесса ферментации имеет решающее значение для максимизации производства лимонной кислоты. Для улучшения передачи кислорода могут использоваться различные стратегии, такие как использование воздуха, обогащенного кислородом, или оптимизация конструкции импеллера.

2. Поддержание постоянного времени перемешивания

Эффективное перемешивание имеет решающее значение для обеспечения однородности в биореакторе, предотвращения ограничений по субстрату или питательным веществам и рассеивания тепла. Поддержание постоянного времени перемешивания во время масштабирования важно для обеспечения того, чтобы клетки подвергались воздействию однородной среды и чтобы градиенты питательных веществ, pH и температуры были сведены к минимуму. На время перемешивания могут влиять такие факторы, как конструкция импеллера, скорость импеллера и геометрия биореактора.

Рассмотрим производство рекомбинантных белков в культуре клеток млекопитающих. Клетки млекопитающих чувствительны к сдвигу, и чрезмерное перемешивание может повредить клетки и снизить выход белка. Однако недостаточное перемешивание может привести к ограничениям по питательным веществам и слипанию клеток. Оптимизация времени перемешивания для балансировки этих конкурирующих факторов имеет решающее значение для успешного масштабирования.

3. Поддержание постоянной скорости сдвига

Скорость сдвига, скорость, с которой смежные слои жидкости движутся относительно друг друга, может оказывать значительное влияние на жизнеспособность клеток и качество продукта, особенно для чувствительных к сдвигу клеток, таких как клетки млекопитающих и растительные клетки. Поддержание постоянной скорости сдвига во время масштабирования важно для минимизации повреждения клеток и обеспечения стабильного качества продукта. Скорость сдвига можно контролировать, регулируя такие параметры, как скорость импеллера и конструкция импеллера.

Например, в производстве моноклональных антител в клетках CHO чрезмерное сдвиговое напряжение может привести к лизису клеток и высвобождению внутриклеточных протеаз, которые могут разрушать антитела. Использование импеллеров с низким сдвигом и оптимизация скорости перемешивания могут помочь минимизировать сдвиговое напряжение и улучшить производство антител.

4. Поддержание постоянной удельной мощности (P/V)

Удельная мощность (P/V) является мерой энергии, вводимой в биореактор для перемешивания и аэрации. Поддержание постоянной P/V во время масштабирования может помочь гарантировать, что характеристики перемешивания и передачи кислорода биореактора будут аналогичными в разных масштабах. Однако важно отметить, что P/V не является единственным фактором, влияющим на перемешивание и передачу кислорода, и следует также учитывать другие параметры, такие как конструкция импеллера и геометрия биореактора.

Во многих бактериальных ферментациях более высокая P/V может быть приемлемой из-за более устойчивого характера бактериальных клеток по сравнению с клетками млекопитающих. Однако даже в бактериальных ферментациях чрезмерная P/V может привести к увеличению потребления энергии и потенциально к повреждению клеток в некоторых случаях. Поэтому оптимизация P/V в сочетании с другими параметрами имеет решающее значение.

5. Геометрическое подобие

Поддержание геометрического подобия во время масштабирования означает, что соотношения размеров биореактора (например, диаметр, высота, диаметр импеллера) остаются постоянными. Это может помочь гарантировать, что модели потока и характеристики перемешивания биореактора будут аналогичными в разных масштабах. Однако часто невозможно поддерживать идеальное геометрическое подобие из-за практических ограничений, таких как стоимость и ограничения по пространству. Кроме того, идеальное геометрическое подобие не гарантирует идентичную производительность, поскольку гидродинамика определяется не только геометрией.

Например, геометрически подобные биореакторы могут иметь разные соотношения площади поверхности к объему, что может влиять на теплопередачу и скорость испарения. Моделирование вычислительной гидродинамики (CFD) можно использовать для оценки влияния отклонений от геометрического подобия на производительность биореактора.

Проблемы масштабирования ферментации

Масштабирование процессов ферментации представляет собой множество проблем, требующих тщательного рассмотрения различных факторов, которые могут повлиять на производительность процесса.

1. Ограничения по передаче кислорода

По мере увеличения масштаба биореактора становится все труднее поддерживать достаточную передачу кислорода к клеткам. Это связано с тем, что отношение площади поверхности к объему уменьшается, а путь диффузии кислорода увеличивается. Ограничение по кислороду может привести к снижению роста клеток, образования продукта и даже к гибели клеток.

Решения:

• Увеличьте скорость аэрации.
• Увеличьте скорость перемешивания.
• Используйте воздух, обогащенный кислородом, или чистый кислород.
• Оптимизируйте конструкцию импеллера.
• Используйте биореактор с большим отношением площади поверхности к объему.
• Реализуйте стратегии, такие как использование микропузырьков или мембранной аэрации.

2. Отвод тепла

Процессы ферментации выделяют тепло из-за метаболической активности и перемешивания. По мере увеличения масштаба биореактора становится все труднее отводить это тепло, что может привести к повышению температуры и снижению роста клеток и образования продукта. Поддержание оптимальной температуры имеет решающее значение для активности ферментов и общего состояния клеток.

Решения:

• Используйте биореактор с охлаждающей рубашкой или внутренними охлаждающими змеевиками.
• Увеличьте скорость потока охлаждающей жидкости.
• Используйте более эффективную систему охлаждения.
• Оптимизируйте процесс ферментации, чтобы уменьшить выделение тепла.
• Рассмотрите возможность испарительного охлаждения, если это уместно (и если потеря летучих продуктов не вызывает беспокойства).

3. Неоднородности перемешивания

По мере увеличения масштаба биореактора становится все труднее поддерживать равномерное перемешивание по всему объему сосуда. Это может привести к градиентам питательных веществ, pH и температуры, что может негативно повлиять на рост клеток и образование продукта. Мертвые зоны или плохо перемешанные области также могут способствовать накоплению токсичных побочных продуктов.

Решения:

• Оптимизируйте конструкцию импеллера.
• Увеличьте скорость перемешивания.
• Используйте несколько импеллеров.
• Оптимизируйте геометрию биореактора.
• Используйте моделирование CFD для понимания и оптимизации моделей перемешивания.

4. Контроль pH

Поддержание оптимального pH имеет решающее значение для роста клеток и образования продукта. По мере увеличения масштаба биореактора становится все труднее поддерживать равномерный pH по всему объему сосуда. Это может привести к градиентам pH, что может негативно повлиять на рост клеток и образование продукта. Метаболические побочные продукты могут значительно изменить pH, что требует жесткого контроля.

Решения:

• Используйте систему контроля pH с добавлением кислоты и основания.
• Оптимизируйте расположение pH-зонда и точек добавления кислоты/основания.
• Используйте буфер для поддержания стабильного pH.
• Рассмотрите возможность использования онлайн-системы мониторинга и контроля pH.

5. Контроль пенообразования

Пенообразование является распространенной проблемой в процессах ферментации, особенно в тех, которые включают белки или поверхностно-активные вещества. Пена может привести к уменьшению рабочего объема, загрязнению и засорению датчиков и фильтров. Это также препятствует передаче кислорода.

Решения:

• Добавьте пеногасители.
• Оптимизируйте скорость перемешивания и аэрации.
• Используйте механический пеногаситель.
• Рассмотрите возможность использования датчика пены для автоматического добавления пеногасителей.

6. Изменения в морфологии или физиологии

Клетки могут демонстрировать измененную морфологию или физиологию по мере увеличения масштаба. Сдвиговое напряжение или другие изменения в среде биореактора могут привести к тому, что клетки будут производить разные белки или иметь разные скорости роста. Эти изменения могут повлиять на выход и качество продукта. Это особенно распространено у нитчатых организмов или агрегированных клеточных культур.

Решения:

• Тщательно контролируйте клеточную морфологию и физиологию во время масштабирования.
• Отрегулируйте параметры ферментации (например, температуру, pH, уровни питательных веществ) для поддержания оптимального роста клеток и образования продукта.
• Рассмотрите возможность использования посевного материала для постепенной адаптации клеток к среде большего масштаба.
• Используйте технологию анализа процессов (PAT) для мониторинга критических параметров процесса в режиме реального времени.

7. Поддержание стерильности

Поддержание стерильности имеет решающее значение для предотвращения загрязнения и обеспечения качества продукта. По мере увеличения масштаба биореактора становится все труднее поддерживать стерильность из-за увеличения площади поверхности и увеличения количества соединений и точек отбора проб.

Решения:

• Используйте проверенные процедуры стерилизации для всего оборудования и сред.
• Соблюдайте строгие правила асептики во время работы.
• Используйте стерильные фильтры для воздушных и газовых потоков.
• Регулярно проверяйте биореактор на наличие загрязнений.
• Обеспечьте надлежащую герметизацию всех соединений и портов.

Технологии для масштабирования ферментации

Доступно несколько технологий для оказания помощи в масштабировании и оптимизации ферментации. Эти технологии могут помочь преодолеть проблемы, связанные с масштабированием процессов ферментации, и повысить производительность процесса.

1. Вычислительная гидродинамика (CFD)

CFD - это мощный инструмент для моделирования потока жидкости, теплопередачи и массопередачи в биореакторах. CFD можно использовать для оптимизации конструкции биореактора, прогнозирования моделей перемешивания и выявления мертвых зон. Моделирование CFD может помочь прогнозировать условия в больших масштабах на основе мелкомасштабных экспериментов, сокращая количество дорогостоящих пилотных запусков.

Пример: CFD можно использовать для оптимизации конструкции и размещения импеллера в крупномасштабном биореакторе, чтобы обеспечить равномерное перемешивание и передачу кислорода. Он также может выявлять области, где сдвиговое напряжение велико, что позволяет инженерам регулировать конструкцию, чтобы минимизировать повреждение клеток.

2. Технология анализа процессов (PAT)

PAT - это система для проектирования, анализа и контроля производства посредством своевременных измерений (т.е. во время обработки) критических атрибутов качества и атрибутов производительности сырья и находящихся в процессе материалов и процессов с целью обеспечения качества конечного продукта. Инструменты PAT включают датчики для мониторинга pH, температуры, растворенного кислорода, плотности клеток и уровней питательных веществ. Сбор данных в режиме реального времени позволяет немедленно вносить коррективы в процесс ферментации, что приводит к повышению эффективности и воспроизводимости.

Пример: Использование онлайн-спектрометра в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) для мониторинга уровней глюкозы в ферментационном бульоне позволяет регулировать скорость подачи в режиме реального времени, предотвращая ограничение глюкозы или перекармливание, что может негативно повлиять на выход продукта.

3. Статистическое планирование экспериментов (DoE)

DoE - это систематический подход к планированию и проведению экспериментов для определения оптимальных условий работы процесса. DoE можно использовать для оптимизации параметров ферментации, таких как температура, pH, уровни питательных веществ и скорость аэрации. DoE - гораздо более эффективный подход, чем традиционный эксперимент "один фактор за раз".

Пример: Использование DoE для оптимизации концентраций различных питательных веществ в ферментационной среде может значительно улучшить выход продукта. Статистический подход позволяет выявлять взаимодействия между питательными веществами, которые могут быть неочевидны при традиционных экспериментах.

4. Усовершенствованные конструкции биореакторов

Разработано несколько усовершенствованных конструкций биореакторов для повышения производительности процесса. К ним относятся:

• Аэрлифтные биореакторы: В этих биореакторах для перемешивания и передачи кислорода используется воздух. Они особенно полезны для чувствительных к сдвигу клеток.
• Мембранные биореакторы: В этих биореакторах используются мембраны для отделения клеток от ферментационного бульона, что позволяет достичь высокой плотности клеток и непрерывного удаления продукта.
• Волновые биореакторы: В этих биореакторах для перемешивания и аэрации используется качающееся движение. Они особенно полезны для применений в клеточных культурах.
• Биореакторы одноразового использования: Эти биореакторы предварительно стерилизованы и являются одноразовыми, что устраняет необходимость в очистке и стерилизации и снижает риск загрязнения.

Пример: Биореакторы одноразового использования все чаще используются в биофармацевтической промышленности для производства моноклональных антител. Эти биореакторы предлагают несколько преимуществ, включая сокращение капитальных вложений, более быстрое время оборота и снижение риска загрязнения.

5. Модели уменьшенного масштаба

Модели уменьшенного масштаба - это биореакторы малого масштаба, которые предназначены для имитации условий в крупномасштабном биореакторе. Модели уменьшенного масштаба можно использовать для изучения влияния различных параметров процесса на рост клеток и образование продукта без необходимости проведения экспериментов в крупномасштабном биореакторе. Это экономит время и ресурсы.

Пример: Модель уменьшенного масштаба можно использовать для имитации ограничений по передаче кислорода в крупномасштабном биореакторе. Изучая влияние ограничения по кислороду на рост клеток и образование продукта в модели уменьшенного масштаба, инженеры могут разработать стратегии для преодоления этих ограничений в крупномасштабном биореакторе.

Стратегии успешного масштабирования ферментации

Успешное масштабирование ферментации требует хорошо спланированной и реализованной стратегии, которая решает проблемы и использует доступные технологии.

1. Тщательное понимание процесса

Глубокое понимание процесса ферментации необходимо для успешного масштабирования. Это включает в себя понимание вовлеченных метаболических путей, оптимальных условий роста клеток и критических параметров процесса, которые влияют на выход и качество продукта. Понимание потенциальных ингибирующих факторов также имеет решающее значение. Прочная основа, построенная на хорошо охарактеризованных мелкомасштабных экспериментах, имеет важное значение.

2. Разработка надежного посевного материала

Надежный посевной материал имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы клетки были здоровыми и активно росли при переносе в крупномасштабный биореактор. Посевной материал должен быть разработан для постепенной адаптации клеток к среде большего масштаба. Это часто включает в себя начало с небольшого инокулята в колбе для встряхивания и постепенное увеличение объема инокулята посредством серии последовательно увеличивающихся биореакторов.

3. Реализация поэтапного подхода

Поэтапный подход означает, что уровень строгости и документации должен соответствовать стадии разработки. Разработка процесса на ранней стадии может быть сосредоточена на определении оптимальных параметров ферментации, а разработка процесса на более поздней стадии должна быть сосредоточена на оптимизации и валидации процесса для обеспечения стабильного качества и воспроизводимости продукта.

4. Проведение пилотных исследований

Пилотные исследования являются важным шагом в процессе масштабирования. Пилотные исследования позволяют протестировать процесс ферментации в биореакторе, который ближе по размеру к крупномасштабному биореактору. Это позволяет выявить потенциальные проблемы и оптимизировать процесс перед переходом к полномасштабному производству. Пилотные исследования могут выявить проблемы с перемешиванием, теплопередачей или контролем pH, которые не были очевидны в меньшем масштабе.

5. Мониторинг критических параметров процесса

Непрерывный мониторинг критических параметров процесса (CPP) необходим для обеспечения стабильного качества и воспроизводимости продукта. CPP включают температуру, pH, растворенный кислород, плотность клеток и уровни питательных веществ. Мониторинг в режиме реального времени позволяет немедленно вносить коррективы в процесс ферментации, предотвращая отклонения от оптимальных условий работы.

6. Реализация стратегий контроля процесса

Стратегии контроля процесса необходимы для поддержания процесса ферментации в пределах желаемого рабочего диапазона. Это включает в себя реализацию контуров управления с обратной связью для автоматической регулировки таких параметров, как температура, pH и растворенный кислород. Усовершенствованные стратегии управления, такие как прогнозное управление моделью (MPC), можно использовать для оптимизации процесса ферментации в режиме реального времени.

7. Разработка тщательного протокола очистки и стерилизации

Тщательный протокол очистки и стерилизации необходим для предотвращения загрязнения и обеспечения качества продукта. Протокол должен включать подробные процедуры очистки и стерилизации всего оборудования и сред. Эффективность протокола очистки и стерилизации должна быть проверена, чтобы гарантировать, что он способен удалить все загрязняющие вещества.

8. Документация и отслеживаемость

Подробная документация имеет решающее значение для демонстрации того, что процесс ферментации хорошо контролируется и что продукт соответствует всем требованиям качества. Это включает в себя документирование всех параметров процесса, сырья и результатов анализа. Необходимо вести всесторонний журнал аудита для обеспечения отслеживаемости всех данных.

Глобальные тематические исследования по масштабированию ферментации

Изучение историй успешного масштабирования ферментации со всего мира предлагает ценные идеи и извлеченные уроки.

1. Производство инсулина в Дании

Novo Nordisk, датская фармацевтическая компания, является мировым лидером в производстве инсулина. Компания успешно масштабировала свои процессы ферментации для производства рекомбинантного инсулина в Saccharomyces cerevisiae. Ключом к их успеху стала реализация передовых стратегий контроля процесса и использование биореакторов одноразового использования. Они также используют передовые методы обработки вниз по потоку для очистки инсулина в соответствии со строгими нормативными требованиями во всем мире.

2. Производство биотоплива в Бразилии

Бразилия является мировым лидером в производстве этанола из сахарного тростника. Бразильские компании разработали высокоэффективные процессы ферментации для производства этанола, который используется в качестве биотоплива. Масштабирование этих процессов включало оптимизацию дрожжевых штаммов, используемых для ферментации, повышение эффективности процесса ферментации и разработку надежных методов обработки вниз по потоку. Обычно используется непрерывная ферментация.

3. Производство антибиотиков в Индии

Индия является крупным производителем антибиотиков. Индийские фармацевтические компании успешно масштабировали свои процессы ферментации для производства различных антибиотиков, включая пенициллин и цефалоспорины. Это включало оптимизацию условий ферментации, повышение эффективности процесса ферментации и разработку надежных методов обработки вниз по потоку. Они также сосредоточились на экономически эффективных стратегиях производства, чтобы конкурировать на мировом рынке.

4. Производство промышленных ферментов в Китае

Китай является крупным производителем промышленных ферментов. Китайские компании масштабировали свои процессы ферментации для производства различных ферментов, включая амилазы, протеазы и липазы. Эти ферменты используются в широком спектре отраслей, включая производство продуктов питания и напитков, текстиль и моющие средства. Эффективная крупномасштабная ферментация с использованием генетически модифицированных организмов (ГМО) является обычной практикой. Проблемы включают в себя решение проблемы разнообразия сырья и поддержание контроля качества.

Будущее масштабирования ферментации

Область масштабирования ферментации постоянно развивается, разрабатываются новые технологии и стратегии для повышения производительности процесса и снижения затрат. Некоторые из ключевых тенденций в масштабировании ферментации включают:

• Расширение использования автоматизации и робототехники: Автоматизация и робототехника могут помочь повысить эффективность и воспроизводимость процессов ферментации.
• Разработка более эффективных конструкций биореакторов: Разрабатываются новые конструкции биореакторов для улучшения перемешивания, передачи кислорода и теплопередачи.
• Расширение использования технологии анализа процессов (PAT): PAT может помочь контролировать критические параметры процесса в режиме реального времени, позволяя немедленно вносить коррективы в процесс ферментации.
• Интеграция анализа данных и искусственного интеллекта (AI): Анализ данных и AI можно использовать для оптимизации процессов ферментации и прогнозирования производительности процесса.
• Акцент на устойчивость: Компании все больше внимания уделяют разработке устойчивых процессов ферментации, которые минимизируют отходы и потребление энергии.

Заключение

Масштабирование ферментации - это сложный и трудный процесс, но он необходим для коммерциализации биотехнологических инноваций. Понимая ключевые принципы масштабирования ферментации, решая проблемы, используя доступные технологии и реализуя хорошо спланированную стратегию, компании могут успешно масштабировать свои процессы ферментации и получить конкурентное преимущество на мировом рынке. Непрерывные инновации и акцент на устойчивость будут иметь решающее значение для будущего ферментационной технологии во всем мире.