Scalarea: Un ghid cuprinzător pentru fermentația comercială

Fermentația este o piatră de temelie a numeroase industrii, de la alimente și băuturi la produse farmaceutice și biocombustibili. Deși o fermentație de succes la scară de laborator este o realizare semnificativă, transpunerea acestui succes în producția comercială necesită o planificare, execuție și optimizare atentă. Acest ghid oferă o imagine de ansamblu cuprinzătoare a considerațiilor cheie și a celor mai bune practici pentru scalarea proceselor de fermentație comercială.

De ce este dificilă scalarea fermentației?

Scalarea unui proces de fermentație nu înseamnă pur și simplu creșterea volumului. Mai mulți factori care sunt ușor de controlat la scară mică devin semnificativ mai complecși pe măsură ce procesul crește. Aceștia includ:

• Transferul de căldură: Menținerea temperaturii optime este crucială pentru creșterea microbiană și formarea produsului. Bioreactoarele mai mari au un raport suprafață-volum mai mic, ceea ce face eliminarea căldurii mai dificilă. O răcire inadecvată poate duce la supraîncălzire și moarte celulară, în timp ce o răcire excesivă poate încetini procesul de fermentație.
• Transferul de masă: Transferul de oxigen este adesea un factor limitativ în fermentațiile aerobe. Pe măsură ce densitatea culturii crește, cererea de oxigen crește. Asigurarea unei aprovizionări adecvate cu oxigen în întregul bioreactor devine din ce în ce mai dificilă la scări mai mari. Amestecarea, barbotarea și designul reactorului joacă roluri cruciale în eficiența transferului de oxigen.
• Amestecarea: O amestecare eficientă este esențială pentru menținerea omogenității, distribuirea nutrienților și eliminarea subproduselor metabolice. O amestecare deficitară poate duce la gradienți de pH, temperatură și concentrație de nutrienți, care pot afecta negativ creșterea celulară și formarea produsului. Tipul și configurația rotoarelor, designul deflectoarelor și viteza de amestecare trebuie luate în considerare cu atenție.
• Stresul de forfecare: Stresul excesiv de forfecare de la rotoare poate deteriora celulele, în special cele sensibile la forfecare. Optimizarea designului rotorului și a vitezei de amestecare este crucială pentru a minimiza stresul de forfecare, menținând în același timp o amestecare adecvată. Unele celule (de ex., ciupercile filamentoase) sunt mai susceptibile la deteriorarea prin forfecare decât altele.
• Sterilitatea: Menținerea sterilității este primordială în procesele de fermentație. Riscul de contaminare crește odată cu dimensiunea și complexitatea bioreactorului. Procedurile robuste de sterilizare, tehnicile aseptice și sistemele închise sunt esențiale pentru a preveni contaminarea și a asigura calitatea produsului.
• Controlul pH-ului: Menținerea intervalului optim de pH este critică pentru activitatea enzimatică și viabilitatea celulară. Pe măsură ce fermentația progresează, producția de acizi sau baze poate cauza fluctuații semnificative ale pH-ului. Un control precis al pH-ului necesită sisteme sofisticate de monitorizare și control.
• Monitorizarea și controlul procesului: Monitorizarea și controlul eficient al parametrilor critici ai procesului (de ex., temperatură, pH, oxigen dizolvat, niveluri de nutrienți) este crucial pentru o performanță constantă și calitatea produsului. Sistemele de monitorizare în timp real și de control automatizat sunt esențiale pentru fermentațiile la scară largă.
• Modificări metabolice dependente de scară: Celulele se pot comporta diferit în fermentatoarele la scară largă în comparație cu culturile la scară mică. Factori precum disponibilitatea oxigenului, stresul de forfecare și gradienții de nutrienți pot modifica căile metabolice și pot afecta randamentul și calitatea produsului. Aceste modificări trebuie studiate cu atenție și abordate în timpul scalării.

Etapele scalării fermentației

Procesul de scalare implică de obicei mai multe etape, fiecare cu propriile obiective și provocări:

1. Dezvoltarea culturii de inocul

Cultura de inocul servește drept inocul pentru fermentatorul de producție. Este crucial să se dezvolte o cultură de inocul sănătoasă, în creștere activă și fără contaminare. Acest lucru implică de obicei mai multe etape de creștere, pornind de la o cultură stoc crioconservată și progresând prin baloane de agitare, bioreactoare mici și, în cele din urmă, la un fermentator de inocul. Cultura de inocul ar trebui să fie fiziologic similară cu celulele dorite în fermentatorul de producție.

Exemplu: O companie farmaceutică care dezvoltă un nou antibiotic ar putea începe cu o tulpină stoc congelată a microorganismului producător. Această tulpină este reactivată într-un balon de agitare, apoi transferată într-un bioreactor mic (de ex., 2L). Biomasa din acest bioreactor inoculează apoi un fermentator de inocul mai mare (de ex., 50L), care furnizează inoculul pentru fermentatorul de producție.

2. Fermentația la scară pilot

Fermentația la scară pilot face legătura între laborator și producția industrială. Vă permite să testați și să optimizați procesul de fermentație în condiții care seamănă mai mult cu mediul de producție la scară completă. Studiile la scară pilot ajută la identificarea problemelor potențiale de scalare și la rafinarea parametrilor de operare. Aceste experimente implică de obicei bioreactoare cu volume cuprinse între 50L și 500L.

Exemplu: O companie de biocombustibili ar putea folosi un bioreactor de 100L pentru a evalua performanța unei noi tulpini de drojdie modificată genetic pentru producția de etanol. Ei ar optimiza parametri precum temperatura, pH-ul și ratele de alimentare cu nutrienți pentru a maximiza randamentul și productivitatea etanolului.

3. Fermentația la scară de producție

Etapa finală este fermentația la scară de producție, unde produsul este fabricat în cantități mari pentru vânzare comercială. Bioreactoarele la scară de producție pot varia de la câteva mii de litri la sute de mii de litri. Menținerea unei performanțe constante și a calității produsului la această scară necesită o atenție deosebită la detalii și sisteme robuste de control al procesului.

Exemplu: O fabrică de bere ar putea folosi un fermentator de 10.000L pentru a produce bere la scară comercială. Ei ar monitoriza cu atenție nivelurile de temperatură, pH și oxigen dizolvat pentru a asigura o aromă și o calitate constante.

Considerații cheie pentru scalarea fermentației

1. Proiectarea bioreactorului

Bioreactorul este inima procesului de fermentație. Alegerea designului corect al bioreactorului este crucială pentru o scalare de succes. Considerațiile cheie includ:

• Tipul de bioreactor: Diferite tipuri de bioreactoare sunt potrivite pentru diferite aplicații. Reactoarele cu rezervor agitat sunt cel mai comun tip, dar alte opțiuni includ reactoare air-lift, reactoare cu coloană de bule și reactoare cu pat umplut. Alegerea depinde de cerințele specifice ale procesului de fermentație, cum ar fi tipul de microorganism, cererea de oxigen și sensibilitatea la stresul de forfecare.
• Sistemul de amestecare: Sistemul de amestecare trebuie să asigure o amestecare adecvată pentru omogenitate, distribuția nutrienților și transferul de oxigen. Tipurile comune de rotoare includ turbine Rushton, turbine cu pale înclinate și elice marine. Numărul și configurația rotoarelor, designul deflectoarelor și viteza de amestecare trebuie optimizate pentru bioreactorul și procesul de fermentație specific.
• Sistemul de barbotare: Sistemul de barbotare introduce aer sau oxigen în bioreactor. Tipul și dimensiunea barbotorului, debitul de gaz și compoziția gazului trebuie controlate cu atenție pentru a optimiza transferul de oxigen fără a provoca spumare excesivă sau deteriorarea celulelor.
• Sistemul de transfer de căldură: Sistemul de transfer de căldură trebuie să mențină bioreactorul la temperatura optimă pentru creșterea celulară și formarea produsului. Acest lucru implică de obicei un vas cu manta cu fluid de răcire sau încălzire în circulație. Capacitatea de transfer de căldură trebuie să fie suficientă pentru a elimina căldura generată de procesul de fermentație.
• Instrumentație și control: Bioreactorul trebuie să fie echipat cu senzori și sisteme de control pentru a monitoriza și regla parametrii critici ai procesului, cum ar fi temperatura, pH-ul, oxigenul dizolvat și nivelurile de nutrienți. Sistemele de control automatizate sunt esențiale pentru menținerea unei performanțe constante și a calității produsului.

2. Optimizarea procesului

Optimizarea procesului implică identificarea și optimizarea parametrilor cheie ai procesului care afectează creșterea celulară, formarea produsului și calitatea produsului. Acest lucru implică de obicei o combinație de studii experimentale și modelare matematică.

• Optimizarea mediului: Mediul de fermentație trebuie să furnizeze toți nutrienții necesari pentru creșterea celulară și formarea produsului. Optimizarea compoziției mediului poate îmbunătăți semnificativ randamentul și productivitatea produsului. Aceasta poate implica variația concentrațiilor de surse de carbon, surse de azot, vitamine și minerale. Planurile experimentale statistice, cum ar fi metodologia suprafeței de răspuns (RSM), pot fi utilizate pentru a optimiza eficient compoziția mediului.
• Optimizarea temperaturii: Temperatura optimă pentru creșterea celulară și formarea produsului depinde de microorganismul specific. Temperatura poate afecta activitatea enzimatică, fluiditatea membranei și stabilitatea proteinelor. Temperatura optimă ar trebui determinată experimental.
• Optimizarea pH-ului: Intervalul optim de pH pentru creșterea celulară și formarea produsului depinde, de asemenea, de microorganismul specific. pH-ul poate afecta activitatea enzimatică, permeabilitatea membranei celulare și solubilitatea proteinelor. Un control precis al pH-ului este esențial pentru o performanță optimă a fermentației.
• Optimizarea oxigenului dizolvat: Menținerea unor niveluri adecvate de oxigen dizolvat este crucială pentru fermentațiile aerobe. Nivelul optim de oxigen dizolvat depinde de cererea de oxigen a microorganismului și de capacitatea de transfer de oxigen a bioreactorului. Nivelurile de oxigen dizolvat pot fi controlate prin ajustarea vitezei de agitare, a ratei de aerare și a îmbogățirii cu oxigen.
• Strategii de alimentare: Pentru fermentațiile fed-batch și continue, rata de alimentare și compoziția trebuie optimizate cu atenție pentru a maximiza randamentul și productivitatea produsului. Strategiile de control cu feedback pot fi utilizate pentru a ajusta rata de alimentare pe baza măsurătorilor în timp real ale concentrației de glucoză, pH-ului sau oxigenului dizolvat.

3. Monitorizare și control

Monitorizarea și controlul eficient al parametrilor critici ai procesului este esențial pentru o performanță constantă și calitatea produsului. Acest lucru necesită utilizarea de senzori, sisteme de control și tehnici de analiză a datelor adecvate.

• Senzori: Sunt disponibili diverși senzori pentru monitorizarea parametrilor critici ai procesului, inclusiv temperatura, pH-ul, oxigenul dizolvat, concentrația de glucoză, concentrația de biomasă și concentrația de produs. Alegerea senzorului depinde de parametrul specific măsurat și de cerințele procesului de fermentație.
• Sisteme de control: Sistemele de control automatizate sunt utilizate pentru a regla parametrii procesului pe baza feedback-ului de la senzori. Sistemele de control comune includ controlerele PID (proporțional-integral-derivat), care ajustează variabilele manipulate (de ex., temperatura, pH-ul, viteza de agitare) pentru a menține valorile de referință dorite.
• Analiza datelor: Datele colectate de la senzori și sistemele de control pot fi analizate pentru a identifica tendințe, a detecta anomalii și a optimiza performanța procesului. Tehnicile de control statistic al procesului (SPC) pot fi utilizate pentru a monitoriza variabilitatea procesului și a identifica problemele potențiale înainte ca acestea să afecteze calitatea produsului.
• Tehnologia Analitică a Proceselor (PAT): PAT este un cadru pentru proiectarea, analiza și controlul proceselor de fabricație prin măsurători prompte ale atributelor critice de calitate (CQA) și ale parametrilor critici ai procesului (CPP). PAT urmărește să îmbunătățească înțelegerea procesului, să reducă variabilitatea și să sporească calitatea produsului.

4. Asigurarea sterilității

Menținerea sterilității este primordială în procesele de fermentație. Contaminarea poate duce la alterarea produsului, randament redus și chiar la eșecul complet al procesului. Implementarea unor proceduri robuste de sterilizare și a unor tehnici aseptice este esențială.

• Sterilizarea echipamentelor: Toate echipamentele care intră în contact cu bulionul de fermentație, inclusiv bioreactorul, conductele și senzorii, trebuie sterilizate complet înainte de utilizare. Sterilizarea cu abur este cea mai comună metodă, dar alte opțiuni includ autoclavarea, filtrarea și sterilizarea chimică.
• Sterilizarea mediilor: Mediul de fermentație trebuie, de asemenea, sterilizat pentru a elimina orice microorganisme contaminante. Acest lucru se face de obicei prin autoclavare sau sterilizare prin filtrare.
• Tehnici aseptice: Toate operațiunile care implică deschiderea bioreactorului sau introducerea de materiale în bulionul de fermentație trebuie efectuate folosind tehnici aseptice. Aceasta include utilizarea de echipamente sterile, purtarea de mănuși sterile și lucrul într-un mediu curat.
• Filtrarea aerului: Aerul care intră în bioreactor trebuie filtrat prin filtre sterile pentru a elimina orice microorganisme din aer.
• Sisteme închise: Utilizarea sistemelor închise minimizează riscul de contaminare. Acest lucru implică conectarea tuturor echipamentelor și conductelor într-o buclă închisă și evitarea oricăror transferuri deschise de materiale.

5. Controlul spumei

Formarea spumei este o problemă comună în procesele de fermentație, în special cele care implică proteine sau surfactanți. Spuma excesivă poate duce la un transfer redus de oxigen, contaminare și pierderea produsului. Spuma poate fi controlată prin adăugarea de agenți antispumanți sau prin utilizarea de spărgătoare mecanice de spumă.

• Agenți antispumanți: Agenții antispumanți sunt substanțe chimice care reduc tensiunea superficială a bulionului de fermentație, prevenind formarea spumei. Agenții antispumanți comuni includ siliconii, uleiurile vegetale și acizii grași. Alegerea agentului antispumant depinde de procesul specific de fermentație și de sensibilitatea microorganismului.
• Spărgătoare mecanice de spumă: Spărgătoarele mecanice de spumă folosesc lame rotative sau alte dispozitive pentru a sparge fizic spuma. Acestea sunt adesea folosite în combinație cu agenți antispumanți.

Strategii pentru o scalare de succes

1. Abordarea QbD (Calitatea prin Proiectare)

QbD este o abordare sistematică a dezvoltării care începe cu obiective predefinite și pune accent pe înțelegerea produsului și a procesului și pe controlul procesului. Aplicarea principiilor QbD la scalarea fermentației ajută la asigurarea unei calități și performanțe constante ale produsului.

Elementele cheie ale QbD includ:

• Definirea profilului de calitate țintă al produsului (QTPP): QTPP descrie caracteristicile dorite ale produsului final, cum ar fi puritatea, potența și stabilitatea.
• Identificarea atributelor critice de calitate (CQA): CQA sunt proprietățile fizice, chimice, biologice sau microbiologice care trebuie controlate pentru a asigura calitatea dorită a produsului.
• Identificarea parametrilor critici ai procesului (CPP): CPP sunt parametrii procesului care pot afecta CQA-urile.
• Stabilirea spațiului de proiectare: Spațiul de proiectare este combinația multidimensională și interacțiunea variabilelor de intrare (de ex., CPP) și a parametrilor de proces care au demonstrat că asigură calitatea. Lucrul în interiorul spațiului de proiectare asigură că produsul îndeplinește atributele de calitate dorite.
• Implementarea unei strategii de control: Strategia de control descrie cum vor fi monitorizați și controlați CPP-urile pentru a se asigura că procesul rămâne în spațiul de proiectare și că produsul îndeplinește atributele de calitate dorite.

2. Dinamica fluidelor computațională (CFD)

CFD este un instrument puternic pentru simularea fluxului de fluide, a transferului de căldură și a transferului de masă în bioreactoare. Simulațiile CFD pot fi utilizate pentru a optimiza designul bioreactorului, sistemele de amestecare și sistemele de barbotare. Ele pot ajuta, de asemenea, la identificarea problemelor potențiale, cum ar fi zonele moarte și punctele fierbinți de stres de forfecare. CFD poate reduce numărul de experimente costisitoare și consumatoare de timp la scară pilot necesare pentru scalare.

3. Modele la scară redusă

Modelele la scară redusă sunt bioreactoare la scară mică, proiectate pentru a imita condițiile dintr-un bioreactor de producție la scară largă. Modelele la scară redusă pot fi utilizate pentru a studia efectele diferiților parametri ai procesului asupra creșterii celulare, formării produsului și calității produsului. Ele pot fi, de asemenea, utilizate pentru a depana problemele care apar în timpul scalării. Modelele la scară redusă bine caracterizate pot oferi perspective valoroase și pot accelera procesul de dezvoltare.

4. Modelarea și simularea proceselor

Modelarea și simularea proceselor pot fi utilizate pentru a prezice comportamentul procesului de fermentație la diferite scări și în diferite condiții de operare. Modelele matematice pot fi dezvoltate pe baza principiilor fundamentale ale transferului de masă, transferului de căldură și cineticii de reacție. Aceste modele pot fi utilizate pentru a optimiza parametrii procesului, a proiecta strategii de control și a depana probleme. Instrumente precum MATLAB, gPROMS și Aspen Plus pot fi utilizate pentru modelarea și simularea proceselor.

Considerații privind procesarea downstream

Considerațiile de scalare se extind dincolo de procesul de fermentație în sine. Procesarea downstream, care implică separarea și purificarea produsului din bulionul de fermentație, trebuie, de asemenea, scalată. Alegerea tehnicilor de procesare downstream depinde de natura produsului, de concentrația sa și de puritatea dorită. Tehnicile comune de procesare downstream includ:

• Separarea celulelor: Îndepărtarea celulelor din bulionul de fermentație este adesea primul pas în procesarea downstream. Acest lucru se poate face prin centrifugare, filtrare sau microfiltrare.
• Lizarea celulară: Dacă produsul este intracelular, celulele trebuie lizate pentru a elibera produsul. Acest lucru se poate face prin metode mecanice (de ex., omogenizare, măcinare cu bile) sau metode chimice (de ex., liză enzimatică).
• Izolarea produsului: Produsul poate fi izolat din bulionul de fermentație printr-o varietate de tehnici, inclusiv precipitare, extracție și adsorbție.
• Purificarea produsului: Produsul este de obicei purificat prin tehnici cromatografice, cum ar fi cromatografia de afinitate, cromatografia cu schimb de ioni și cromatografia de excluziune moleculară.
• Formularea produsului: Pasul final în procesarea downstream este formularea produsului într-o formă stabilă și utilizabilă. Aceasta poate implica adăugarea de excipienți, stabilizatori și conservanți.

Exemple globale de scalare reușită a fermentației

Mai multe industrii din întreaga lume se bazează în mare măsură pe scalarea reușită a fermentației. Iată câteva exemple:

• Industria farmaceutică (Global): Producția de antibiotice, vaccinuri și alte produse biofarmaceutice se bazează pe fermentația la scară largă a microorganismelor sau a culturilor celulare. Companii precum Pfizer, Roche și Novartis operează facilități masive de fermentație la nivel mondial.
• Industria alimentară și a băuturilor (Europa, America de Nord, Asia): Producția de bere, vin, iaurt, brânză și alte alimente și băuturi fermentate se bazează pe procese de fermentație controlate. Companii precum Anheuser-Busch InBev (Belgia), Danone (Franța) și Kirin Brewery (Japonia) au perfecționat scalarea fermentației de-a lungul multor ani.
• Industria biocombustibililor (Brazilia, SUA): Producția de etanol din trestie de zahăr (Brazilia) și porumb (SUA) implică fermentația la scară largă a zaharurilor de către drojdie. Companii precum Raizen (Brazilia) și Archer Daniels Midland (SUA) operează facilități de producție de biocombustibili la scară largă.
• Biotehnologie industrială (Danemarca, Germania, China): Producția de enzime, bioplastice și alte produse pe bază de bio se bazează pe fermentația microorganismelor modificate genetic. Companii precum Novozymes (Danemarca), BASF (Germania) și Amyris (SUA) sunt lideri în acest domeniu.

Depanarea problemelor comune de scalare

În ciuda planificării și execuției atente, pot apărea probleme în timpul scalării fermentației. Iată câteva probleme comune și soluții potențiale:

• Randament redus al produsului: Acest lucru s-ar putea datora modificărilor căilor metabolice, limitărilor de nutrienți sau acumulării de subproduse inhibitoare. Revizuiți compoziția mediului, optimizați strategiile de alimentare și asigurați un transfer adecvat de oxigen.
• Risc crescut de contaminare: Acest lucru s-ar putea datora unor proceduri de sterilizare inadecvate sau unor încălcări ale tehnicii aseptice. Revizuiți protocoalele de sterilizare, îmbunătățiți filtrarea aerului și implementați proceduri aseptice mai stricte.
• Supraproducția de spumă: Acest lucru s-ar putea datora modificărilor în compoziția mediului sau fiziologiei celulare. Optimizați adăugarea de agent antispumant sau instalați un spărgător mecanic de spumă.
• Modificări ale morfologiei celulare: Acest lucru s-ar putea datora modificărilor stresului de forfecare sau gradienților de nutrienți. Optimizați designul rotorului, viteza de amestecare și strategiile de alimentare.
• Instabilitatea produsului: Acest lucru s-ar putea datora modificărilor de pH, temperatură sau prezenței enzimelor de degradare. Optimizați parametrii procesului și adăugați stabilizatori în mediu.

Tendințe viitoare în scalarea fermentației

Domeniul fermentației este în continuă evoluție. Unele dintre tendințele cheie care modelează viitorul scalării fermentației includ:

• Fermentația continuă: Fermentația continuă oferă mai multe avantaje față de fermentația în loturi, inclusiv o productivitate mai mare, costuri de operare mai mici și o calitate mai constantă a produsului.
• Bioreactoare de unică folosință: Bioreactoarele de unică folosință elimină necesitatea curățării și sterilizării, reducând riscul de contaminare și simplificând operațiunile.
• Control avansat al proceselor: Tehnicile avansate de control al proceselor, cum ar fi controlul predictiv bazat pe model (MPC) și învățarea automată, sunt utilizate pentru a optimiza procesele de fermentație în timp real.
• Biologie sintetică: Biologia sintetică este utilizată pentru a proiecta microorganisme cu capacități metabolice și productivități îmbunătățite.
• Comunități microbiene: Exploatarea comunităților și consorțiilor microbiene poate debloca noi căi metabolice și poate îmbunătăți eficiența bioproceselor.

Concluzie

Scalarea proceselor de fermentație comercială este un pas complex, dar esențial, în aducerea bioproduselor pe piață. Prin luarea în considerare atentă a factorilor cheie discutați în acest ghid, inclusiv designul bioreactorului, optimizarea procesului, monitorizarea și controlul, asigurarea sterilității și controlul spumei, companiile pot scala cu succes procesele lor de fermentație și pot obține o calitate și o performanță constantă a produsului. Adoptarea noilor tehnologii și metodologii, cum ar fi QbD, CFD, modelele la scară redusă și controlul avansat al proceselor, va spori și mai mult eficiența și robustețea operațiunilor de fermentație comercială la nivel mondial.