Pakārtotās apstrādes zinātne: Visaptverošs ceļvedis

Pakārtotā apstrāde (DSP) ir kritisks posms bioražošanā, kas ietver visas operācijas, kas nepieciešamas, lai izolētu un attīrītu mērķa produktu no sarežģīta bioloģiskā maisījuma. Šis process seko augšupējai apstrādei (USP), kur produkts tiek radīts šūnu kultūrā vai fermentācijā. DSP efektivitāte un rezultativitāte tieši ietekmē produkta iznākumu, tīrību un, galu galā, biofarmaceitisko preparātu, enzīmu, biodegvielu un citu bioproduktu komerciālo dzīvotspēju.

Izpratne par pakārtotās apstrādes pamatiem

DSP ietver virkni soļu, kas paredzēti, lai atdalītu vēlamo produktu no šūnu atliekām, barotnes komponentiem un citiem piemaisījumiem. Šie soļi bieži tiek sakārtoti secībā, kas pakāpeniski koncentrē un attīra mērķa molekulu. Konkrētie DSP izmantotie soļi ir atkarīgi no produkta veida, ražošanas apjoma un nepieciešamā tīrības līmeņa.

Galvenie pakārtotās apstrādes mērķi:

• Izolēšana: Produkta atdalīšana no fermentācijas buljona vai šūnu kultūras lielākās daļas.
• Attīrīšana: Nevēlamu piemaisījumu, piemēram, saimniekšūnas proteīnu (HCPs), DNS, endotoksīnu un barotnes komponentu, noņemšana.
• Koncentrēšana: Produkta koncentrācijas palielināšana līdz vēlamajam līmenim formulēšanai un galīgai lietošanai.
• Formulēšana: Attīrītā produkta sagatavošana stabilā un lietojamā formā.

Biežākās pakārtotās apstrādes metodes

DSP tiek izmantotas dažādas metodes, no kurām katra piedāvā unikālas priekšrocības konkrētiem atdalīšanas un attīrīšanas uzdevumiem.

1. Šūnu sagraušana

Produktiem, kas atrodas intracelulāri, pirmais solis ir sagraut šūnas, lai atbrīvotu produktu. Biežākās šūnu sagraušanas metodes ietver:

• Mehāniskā līze: Augstspiediena homogenizatoru, lodīšu dzirnavu vai ultraskaņas izmantošana, lai fiziski sagrautu šūnas. Piemēram, ražojot rekombinantos proteīnus *E. coli* baktērijās, bieži izmanto homogenizāciju, lai atbrīvotu proteīnu no šūnām. Dažās liela mēroga ražotnēs vairāki homogenizatori var darboties paralēli, lai apstrādātu lielus apjomus.
• Ķīmiskā līze: Detergentu, šķīdinātāju vai enzīmu izmantošana, lai sagrautu šūnas membrānu. Šo metodi bieži izmanto jutīgākiem produktiem, kur skarbas mehāniskās metodes varētu izraisīt noārdīšanos.
• Enzimātiskā līze: Enzīmu, piemēram, lizocīma, izmantošana, lai noārdītu šūnas sieniņu. To parasti izmanto baktēriju šūnām, nodrošinot maigāku pieeju nekā mehāniskās metodes.

2. Cieto un šķidro daļiņu atdalīšana

Pēc šūnu sagraušanas cieto un šķidro daļiņu atdalīšana ir būtiska, lai noņemtu šūnu atliekas un citas cietās daļiņas. Biežākās metodes ietver:

• Centrifugēšana: Centrbēdzes spēka izmantošana, lai atdalītu cietās daļiņas no šķidrumiem, pamatojoties uz blīvuma atšķirībām. To plaši izmanto liela mēroga bioprocesos tās augstās caurlaidspējas un efektivitātes dēļ. Atkarībā no padeves plūsmas tilpuma un īpašībām tiek izmantoti dažādi centrifūgu veidi, piemēram, disku centrifūgas.
• Mikrofiltrācija: Membrānu ar poru izmēru no 0.1 līdz 10 μm izmantošana, lai noņemtu baktērijas, šūnu atliekas un citas cietās daļiņas. Mikrofiltrāciju bieži izmanto kā priekšapstrādes posmu pirms ultrafiltrācijas vai hromatogrāfijas.
• Dziļuma filtrācija: Porainas matricas izmantošana, lai aizturētu cietās daļiņas, kad šķidrums plūst cauri. Dziļuma filtrus bieži izmanto, lai dzidrinātu šūnu kultūru buljonus ar augstu šūnu blīvumu.

3. Hromatogrāfija

Hromatogrāfija ir spēcīga atdalīšanas metode, kas izmanto molekulu fizikālo un ķīmisko īpašību atšķirības, lai panāktu augstas izšķirtspējas attīrīšanu. DSP parasti tiek izmantoti vairāki hromatogrāfijas veidi:

• Afinitātes hromatogrāfija: Specifisku saistīšanās mijiedarbību izmantošana starp mērķa molekulu un ligandu, kas imobilizēts uz cieta nesēja. Šī ir ļoti selektīva metode, ko bieži izmanto kā sākotnējo attīrīšanas posmu. Piemēram, His-tag afinitātes hromatogrāfiju plaši izmanto, lai attīrītu rekombinantos proteīnus, kas satur polihistidīna atzīmi.
• Jonu apmaiņas hromatogrāfija (IEX): Molekulu atdalīšana, pamatojoties uz to neto lādiņu. Katjonu apmaiņas hromatogrāfiju izmanto, lai saistītu pozitīvi lādētas molekulas, savukārt anjonu apmaiņas hromatogrāfija saista negatīvi lādētas molekulas. IEX parasti izmanto proteīnu, peptīdu un nukleīnskābju attīrīšanai.
• Izslēgšanas hromatogrāfija (SEC): Molekulu atdalīšana pēc to izmēra. Šo metodi bieži izmanto pēdējos attīrīšanas posmos ("polishing"), lai noņemtu mērķa molekulas agregātus vai fragmentus.
• Hidrofobās mijiedarbības hromatogrāfija (HIC): Molekulu atdalīšana, pamatojoties uz to hidrofobitāti. HIC bieži izmanto, lai attīrītu proteīnus, kas ir jutīgi pret denaturāciju.
• Vairāku režīmu hromatogrāfija: Vairāku mijiedarbības mehānismu apvienošana, lai uzlabotu selektivitāti un attīrīšanas efektivitāti.

4. Membrānu filtrācija

Membrānu filtrācijas metodes tiek izmantotas koncentrēšanai, diafiltrācijai un buferšķīduma apmaiņai.

• Ultrafiltrācija (UF): Membrānu ar poru izmēru no 1 līdz 100 nm izmantošana, lai koncentrētu produktu un noņemtu zemas molekulmasas piemaisījumus. UF plaši izmanto proteīnu, antivielu un citu biomolekulu koncentrēšanai.
• Diafiltrācija (DF): UF membrānu izmantošana, lai no produkta šķīduma noņemtu sāļus, šķīdinātājus un citas mazas molekulas. DF bieži izmanto buferšķīduma apmaiņai un atsāļošanai.
• Nanofiltrācija (NF): Membrānu ar poru izmēru, kas mazāks par 1 nm, izmantošana, lai noņemtu divvērtīgos jonus un citas mazas lādētas molekulas.
• Reversā osmoze (RO): Membrānu ar ārkārtīgi maziem poru izmēriem izmantošana, lai no ūdens noņemtu praktiski visas izšķīdušās vielas. RO izmanto ūdens attīrīšanai un augsti koncentrētu šķīdumu koncentrēšanai.

5. Nogulsnēšana

Nogulsnēšana ietver reaģenta pievienošanu šķīdumam, lai samazinātu mērķa molekulas šķīdību, liekot tai izkrist no šķīduma nogulsnēs. Biežākie nogulsnēšanas aģenti ietver:

• Amonija sulfāts: Plaši izmantots nogulsnēšanas aģents, kas var selektīvi nogulsnēt proteīnus, pamatojoties uz to hidrofobitāti.
• Organiskie šķīdinātāji: Piemēram, etanols vai acetons, kas var samazināt proteīnu šķīdību, mainot šķīduma dielektrisko konstanti.
• Polimēri: Piemēram, polietilēnglikols (PEG), kas var izraisīt nogulsnēšanos, izspiežot proteīna molekulas.

6. Vīrusu attīrīšana

Biofarmaceitiskiem produktiem vīrusu attīrīšana ir kritiska drošības prasība. Vīrusu attīrīšanas stratēģijas parasti ietver kombināciju no:

• Vīrusu filtrācija: Filtru ar pietiekami maziem poru izmēriem izmantošana, lai fiziski noņemtu vīrusus.
• Vīrusu inaktivācija: Ķīmisku vai fizisku metožu izmantošana vīrusu inaktivēšanai. Biežākās metodes ietver apstrādi ar zemu pH, termisko apstrādi un UV starojumu.

Izaicinājumi pakārtotajā apstrādē

DSP var būt sarežģīts un izaicinošs process vairāku faktoru dēļ:

• Produkta nestabilitāte: Daudzas biomolekulas ir jutīgas pret temperatūru, pH un bīdes spēkiem, tādēļ ir nepieciešams rūpīgi kontrolēt procesa apstākļus, lai novērstu noārdīšanos.
• Zema produkta koncentrācija: Mērķa molekulas koncentrācija fermentācijas buljonā vai šūnu kultūrā bieži ir zema, kas prasa nozīmīgus koncentrēšanas posmus.
• Sarežģīti maisījumi: Daudzu piemaisījumu, piemēram, saimniekšūnas proteīnu, DNS un endotoksīnu, klātbūtne var apgrūtināt augstas tīrības pakāpes sasniegšanu.
• Augstas izmaksas: DSP var būt dārgs process aprīkojuma, patērējamo materiālu un darbaspēka izmaksu dēļ.
• Normatīvās prasības: Biofarmaceitiskajiem produktiem ir noteiktas stingras normatīvās prasības, kas prasa plašu procesa validāciju un kvalitātes kontroli.

Stratēģijas pakārtotās apstrādes optimizēšanai

Var izmantot vairākas stratēģijas, lai optimizētu DSP un uzlabotu produkta iznākumu un tīrību:

• Procesa intensifikācija: Stratēģiju ieviešana, lai palielinātu DSP operāciju caurlaidspēju un efektivitāti, piemēram, nepārtraukta hromatogrāfija un integrēts procesa dizains.
• Procesa analītiskā tehnoloģija (PAT): Reāllaika uzraudzības un kontroles izmantošana, lai optimizētu procesa parametrus un nodrošinātu konsekventu produkta kvalitāti. PAT rīki var ietvert tiešsaistes sensorus pH, temperatūras, vadītspējas un proteīna koncentrācijas mērīšanai.
• Vienreizlietojamās tehnoloģijas: Vienreizlietojamā aprīkojuma izmantošana, lai samazinātu tīrīšanas validācijas prasības un minimizētu krusteniskās kontaminācijas risku. Vienreizlietojamie bioreaktori, filtri un hromatogrāfijas kolonnas kļūst arvien populārākas bioražošanā.
• Modelēšana un simulācija: Matemātisko modeļu izmantošana, lai prognozētu procesa veiktspēju un optimizētu procesa parametrus. Skaitļošanas šķidrumu dinamiku (CFD) var izmantot, lai optimizētu sajaukšanos un masas pārnesi bioreaktoros un citās procesa iekārtās.
• Automatizācija: DSP operāciju automatizēšana, lai samazinātu manuālo darbu un uzlabotu procesa konsekvenci. Automatizētās hromatogrāfijas sistēmas un šķidrumu apstrādes roboti tiek plaši izmantoti bioražošanā.

Pakārtotās apstrādes piemēri dažādās nozarēs

DSP principi tiek pielietoti dažādās nozarēs:

• Biofarmācija: Monoklonālo antivielu, rekombinanto proteīnu, vakcīnu un gēnu terapiju ražošana. Piemēram, insulīna ražošana ietver vairākus DSP posmus, ieskaitot šūnu līzi, hromatogrāfiju un ultrafiltrāciju.
• Enzīmi: Rūpniecisko enzīmu ražošana izmantošanai pārtikas pārstrādē, mazgāšanas līdzekļos un biodegvielās. Pārtikas rūpniecībā enzīmus, piemēram, amilāzi un proteāzi, ražo fermentācijas ceļā un pēc tam attīra, izmantojot pakārtotās apstrādes metodes.
• Pārtika un dzērieni: Pārtikas piedevu, aromatizētāju un sastāvdaļu ražošana. Piemēram, citronskābes ekstrakcija un attīrīšana no fermentācijas buljoniem ietver DSP metodes, piemēram, nogulsnēšanu un filtrāciju.
• Biodegvielas: Etanola, biodīzeļa un citu biodegvielu ražošana no atjaunojamiem resursiem. Etanola ražošana no kukurūzas ietver fermentāciju, kam seko destilācijas un dehidratācijas posmi, lai attīrītu etanolu.

Jaunākās tendences pakārtotajā apstrādē

DSP joma nepārtraukti attīstās, tiek izstrādātas jaunas tehnoloģijas un pieejas, lai risinātu bioražošanas izaicinājumus. Dažas no jaunākajām tendencēm ietver:

• Nepārtrauktā ražošana: Nepārtrauktu procesu ieviešana, lai uzlabotu efektivitāti un samazinātu izmaksas. Liela mēroga bioražošanā tiek ieviesta nepārtrauktā hromatogrāfija un nepārtrauktas plūsmas reaktori.
• Integrētā bioprocesēšana: USP un DSP operāciju apvienošana vienā, integrētā procesā, lai minimizētu manuālo apstrādi un uzlabotu procesa kontroli.
• Progresīvas hromatogrāfijas metodes: Jaunu hromatogrāfijas sveķu un metožu izstrāde, lai uzlabotu selektivitāti un izšķirtspēju.
• Mākslīgais intelekts un mašīnmācīšanās: MI un ML izmantošana, lai optimizētu DSP procesus un prognozētu procesa veiktspēju. Mašīnmācīšanās algoritmus var izmantot, lai analizētu lielas datu kopas un identificētu optimālos procesa parametrus.
• 3D drukāšana: 3D drukāšanas izmantošana, lai izveidotu pielāgota dizaina atdalīšanas ierīces un hromatogrāfijas kolonnas.

Pakārtotās apstrādes nākotne

DSP nākotni noteiks nepieciešamība pēc efektīvākiem, rentablākiem un ilgtspējīgākiem bioražošanas procesiem. Jaunu tehnoloģiju un pieeju, piemēram, nepārtrauktās ražošanas, integrētās bioprocesēšanas un MI vadītas procesu optimizācijas, izstrādei būs izšķiroša loma šīs nepieciešamības apmierināšanā.

Noslēgums

Pakārtotā apstrāde ir kritiska bioražošanas sastāvdaļa, kam ir būtiska loma plaša bioproduktu klāsta ražošanā. Izprotot DSP principus un metodes un pieņemot inovatīvas stratēģijas procesu optimizēšanai, ražotāji var uzlabot produkta iznākumu, tīrību un, galu galā, savu produktu komerciālo dzīvotspēju. Pašreizējie sasniegumi DSP tehnoloģijās sola turpmāk uzlabot bioražošanas efektivitāti un ilgtspējību nākamajos gados. Sākot ar lieliem farmācijas uzņēmumiem un beidzot ar mazākiem biotehnoloģiju jaunuzņēmumiem, pakārtotās apstrādes zinātnes izpratne ir vissvarīgākā panākumiem bioprocesēšanas nozarē.