Povećanje opsega: Sveobuhvatan vodič za komercijalnu fermentaciju

Fermentacija je kamen temeljac brojnih industrija, od prehrambene i industrije pića do farmaceutske i industrije biogoriva. Iako je uspješna fermentacija na laboratorijskoj razini značajno postignuće, prenošenje tog uspjeha u komercijalnu proizvodnju zahtijeva pažljivo planiranje, izvođenje i optimizaciju. Ovaj vodič pruža sveobuhvatan pregled ključnih razmatranja i najboljih praksi za povećanje opsega komercijalnih procesa fermentacije.

Zašto je povećanje opsega fermentacije izazovno?

Povećanje opsega procesa fermentacije nije samo jednostavno povećanje volumena. Nekoliko čimbenika koji se lako kontroliraju na maloj skali postaju znatno složeniji kako proces raste. To uključuje:

• Prijenos topline: Održavanje optimalne temperature ključno je za rast mikroba i stvaranje proizvoda. Veći bioreaktori imaju manji omjer površine i volumena, što otežava odvođenje topline. Neadekvatno hlađenje može dovesti do pregrijavanja i smrti stanica, dok pretjerano hlađenje može usporiti proces fermentacije.
• Prijenos mase: Prijenos kisika često je ograničavajući faktor u aerobnim fermentacijama. Kako se gustoća kulture povećava, raste i potražnja za kisikom. Osiguravanje odgovarajuće opskrbe kisikom u cijelom bioreaktoru postaje sve teže na većim skalama. Miješanje, upuhivanje i dizajn reaktora igraju ključnu ulogu u učinkovitosti prijenosa kisika.
• Miješanje: Učinkovito miješanje ključno je za održavanje homogenosti, distribuciju hranjivih tvari i uklanjanje metaboličkih nusprodukata. Loše miješanje može dovesti do gradijenata pH, temperature i koncentracije hranjivih tvari, što može negativno utjecati na rast stanica i stvaranje proizvoda. Tip i konfiguracija impelera, dizajn odbojnika i brzina miješanja moraju se pažljivo razmotriti.
• Smično naprezanje: Pretjerano smično naprezanje od impelera može oštetiti stanice, posebno one koje su osjetljive na smicanje. Optimiziranje dizajna impelera i brzine miješanja ključno je za minimiziranje smičnog naprezanja uz održavanje adekvatnog miješanja. Neke stanice (npr. filamentozne gljive) podložnije su oštećenjima od smicanja od drugih.
• Sterilnost: Održavanje sterilnosti od presudne je važnosti u procesima fermentacije. Rizik od kontaminacije raste s veličinom i složenošću bioreaktora. Robusni postupci sterilizacije, aseptičke tehnike i zatvoreni sustavi ključni su za sprječavanje kontaminacije i osiguranje kvalitete proizvoda.
• Kontrola pH: Održavanje optimalnog raspona pH ključno je za aktivnost enzima i vitalnost stanica. Kako fermentacija napreduje, proizvodnja kiselina ili baza može uzrokovati značajne fluktuacije pH. Precizna kontrola pH zahtijeva sofisticirane sustave za praćenje i kontrolu.
• Nadzor i kontrola procesa: Učinkovit nadzor i kontrola kritičnih procesnih parametara (npr. temperatura, pH, otopljeni kisik, razine hranjivih tvari) ključni su za dosljedne performanse i kvalitetu proizvoda. Praćenje u stvarnom vremenu i automatizirani kontrolni sustavi ključni su za fermentacije velikih razmjera.
• Metaboličke promjene ovisne o mjerilu: Stanice se mogu ponašati drugačije u fermentorima velikih razmjera u usporedbi s kulturama malih razmjera. Čimbenici poput dostupnosti kisika, smičnog naprezanja i gradijenata hranjivih tvari mogu promijeniti metaboličke putove i utjecati na prinos i kvalitetu proizvoda. Te promjene treba pažljivo proučiti i riješiti tijekom povećanja opsega.

Faze povećanja opsega fermentacije

Proces povećanja opsega obično uključuje nekoliko faza, svaka sa svojim ciljevima i izazovima:

1. Razvoj kulture inokuluma

Kultura inokuluma služi kao inokulum za proizvodni fermentor. Ključno je razviti kulturu inokuluma koja je zdrava, aktivno raste i bez kontaminacije. To obično uključuje više faza rasta, počevši od krioprezervirane matične kulture i napredujući kroz tikvice za mućkanje, male bioreaktore i na kraju do fermentora za inokulum. Kultura inokuluma trebala bi biti fiziološki slična stanicama željenim u proizvodnom fermentoru.

Primjer: Farmaceutska tvrtka koja razvija novi antibiotik mogla bi započeti sa smrznutom matičnom kulturom mikroorganizma koji ga proizvodi. Ta se kultura oživljava u tikvici za mućkanje, zatim prenosi u mali (npr. 2L) bioreaktor. Biomasa iz ovog bioreaktora zatim inokulira veći (npr. 50L) fermentor za inokulum, koji osigurava inokulum za proizvodni fermentor.

2. Fermentacija na pilot-skali

Fermentacija na pilot-skali premošćuje jaz između laboratorijske i industrijske proizvodnje. Omogućuje vam testiranje i optimizaciju procesa fermentacije u uvjetima koji bliže oponašaju okruženje proizvodnje u punom opsegu. Studije na pilot-skali pomažu identificirati potencijalne probleme s povećanjem opsega i doraditi operativne parametre. Ovi eksperimenti obično uključuju bioreaktore u rasponu od 50L do 500L.

Primjer: Tvrtka za biogoriva mogla bi koristiti bioreaktor od 100L za procjenu performansi novog genetski modificiranog soja kvasca za proizvodnju etanola. Optimizirali bi parametre kao što su temperatura, pH i brzine dodavanja hranjivih tvari kako bi maksimizirali prinos i produktivnost etanola.

3. Fermentacija na proizvodnoj skali

Završna faza je fermentacija na proizvodnoj skali, gdje se proizvod proizvodi u velikim količinama za komercijalnu prodaju. Bioreaktori na proizvodnoj skali mogu varirati od nekoliko tisuća litara do stotina tisuća litara. Održavanje dosljednih performansi i kvalitete proizvoda na ovoj skali zahtijeva pažljivu pozornost na detalje i robusne sustave za kontrolu procesa.

Primjer: Pivovara bi mogla koristiti fermentor od 10.000L za proizvodnju piva na komercijalnoj skali. Pažljivo bi pratili temperaturu, pH i razine otopljenog kisika kako bi osigurali dosljedan okus i kvalitetu.

Ključna razmatranja za povećanje opsega fermentacije

1. Dizajn bioreaktora

Bioreaktor je srce procesa fermentacije. Odabir pravog dizajna bioreaktora ključan je za uspješno povećanje opsega. Ključna razmatranja uključuju:

• Vrsta bioreaktora: Različite vrste bioreaktora prikladne su za različite primjene. Reaktori s miješalom najčešći su tip, ali druge opcije uključuju reaktore s podizanjem zrakom, reaktore s mjehurićastom kolonom i reaktore s ispunom. Izbor ovisi o specifičnim zahtjevima procesa fermentacije, kao što su vrsta mikroorganizma, potražnja za kisikom i osjetljivost na smično naprezanje.
• Sustav miješanja: Sustav miješanja mora osigurati adekvatno miješanje za homogenost, distribuciju hranjivih tvari i prijenos kisika. Uobičajeni tipovi impelera uključuju Rushtonove turbine, turbine s nagnutim lopaticama i brodske propelere. Broj i konfiguracija impelera, dizajn odbojnika i brzina miješanja moraju se optimizirati za specifični bioreaktor i proces fermentacije.
• Sustav upuhivanja: Sustav upuhivanja uvodi zrak ili kisik u bioreaktor. Tip i veličina raspršivača, protok plina i sastav plina moraju se pažljivo kontrolirati kako bi se optimizirao prijenos kisika bez izazivanja prekomjernog pjenjenja ili oštećenja stanica.
• Sustav prijenosa topline: Sustav prijenosa topline mora održavati bioreaktor na optimalnoj temperaturi za rast stanica i stvaranje proizvoda. To obično uključuje posudu s plaštem s cirkulirajućim rashladnim ili grijaćim fluidom. Kapacitet prijenosa topline mora biti dovoljan za uklanjanje topline koju stvara proces fermentacije.
• Instrumentacija i kontrola: Bioreaktor mora biti opremljen senzorima i kontrolnim sustavima za praćenje i regulaciju kritičnih procesnih parametara kao što su temperatura, pH, otopljeni kisik i razine hranjivih tvari. Automatizirani kontrolni sustavi ključni su za održavanje dosljednih performansi i kvalitete proizvoda.

2. Optimizacija procesa

Optimizacija procesa uključuje identificiranje i optimiziranje ključnih procesnih parametara koji utječu na rast stanica, stvaranje proizvoda i kvalitetu proizvoda. To obično uključuje kombinaciju eksperimentalnih studija i matematičkog modeliranja.

• Optimizacija medija: Medij za fermentaciju mora osigurati sve hranjive tvari potrebne za rast stanica i stvaranje proizvoda. Optimiziranje sastava medija može značajno poboljšati prinos i produktivnost proizvoda. To može uključivati variranje koncentracija izvora ugljika, izvora dušika, vitamina i minerala. Statistički eksperimentalni dizajni, kao što je metodologija odzivne površine (RSM), mogu se koristiti za učinkovitu optimizaciju sastava medija.
• Optimizacija temperature: Optimalna temperatura za rast stanica i stvaranje proizvoda ovisi o specifičnom mikroorganizmu. Temperatura može utjecati na aktivnost enzima, fluidnost membrane i stabilnost proteina. Optimalnu temperaturu treba odrediti eksperimentalno.
• Optimizacija pH: Optimalni raspon pH za rast stanica i stvaranje proizvoda također ovisi o specifičnom mikroorganizmu. pH može utjecati na aktivnost enzima, propusnost stanične membrane i topljivost proteina. Precizna kontrola pH ključna je za optimalne performanse fermentacije.
• Optimizacija otopljenog kisika: Održavanje odgovarajućih razina otopljenog kisika ključno je za aerobne fermentacije. Optimalna razina otopljenog kisika ovisi o potražnji mikroorganizma za kisikom i kapacitetu prijenosa kisika bioreaktora. Razine otopljenog kisika mogu se kontrolirati podešavanjem brzine miješanja, brzine aeracije i obogaćivanja kisikom.
• Strategije hranjenja: Za šaržne s pritokom i kontinuirane fermentacije, brzina i sastav hranjenja moraju se pažljivo optimizirati kako bi se maksimizirao prinos i produktivnost proizvoda. Strategije povratne sprege mogu se koristiti za podešavanje brzine hranjenja na temelju mjerenja koncentracije glukoze, pH ili otopljenog kisika u stvarnom vremenu.

3. Nadzor i kontrola

Učinkovit nadzor i kontrola ključnih procesnih parametara ključni su za dosljedne performanse i kvalitetu proizvoda. To zahtijeva upotrebu odgovarajućih senzora, kontrolnih sustava i tehnika analize podataka.

• Senzori: Dostupni su različiti senzori za praćenje kritičnih procesnih parametara, uključujući temperaturu, pH, otopljeni kisik, koncentraciju glukoze, koncentraciju biomase i koncentraciju proizvoda. Izbor senzora ovisi o specifičnom parametru koji se mjeri i zahtjevima procesa fermentacije.
• Kontrolni sustavi: Automatizirani kontrolni sustavi koriste se za regulaciju procesnih parametara na temelju povratnih informacija od senzora. Uobičajeni kontrolni sustavi uključuju PID (proporcionalno-integralno-derivativne) regulatore, koji prilagođavaju manipulirane varijable (npr. temperaturu, pH, brzinu miješanja) kako bi održali željene zadane vrijednosti.
• Analiza podataka: Podaci prikupljeni od senzora i kontrolnih sustava mogu se analizirati kako bi se identificirali trendovi, otkrili anomalije i optimizirale performanse procesa. Tehnike statističke kontrole procesa (SPC) mogu se koristiti za praćenje varijabilnosti procesa i identificiranje potencijalnih problema prije nego što utječu na kvalitetu proizvoda.
• Procesna analitička tehnologija (PAT): PAT je okvir za projektiranje, analizu i kontrolu proizvodnih procesa kroz pravovremena mjerenja kritičnih atributa kvalitete (CQA) i kritičnih procesnih parametara (CPP). Cilj PAT-a je poboljšati razumijevanje procesa, smanjiti varijabilnost i poboljšati kvalitetu proizvoda.

4. Osiguranje sterilnosti

Održavanje sterilnosti od presudne je važnosti u procesima fermentacije. Kontaminacija može dovesti do kvarenja proizvoda, smanjenog prinosa, pa čak i potpunog neuspjeha procesa. Implementacija robusnih postupaka sterilizacije i aseptičkih tehnika je ključna.

• Sterilizacija opreme: Sva oprema koja dolazi u kontakt s fermentacijskom juhom, uključujući bioreaktor, cjevovode i senzore, mora se temeljito sterilizirati prije upotrebe. Sterilizacija parom je najčešća metoda, ali druge opcije uključuju autoklaviranje, filtraciju i kemijsku sterilizaciju.
• Sterilizacija medija: Medij za fermentaciju također se mora sterilizirati kako bi se eliminirali svi kontaminirajući mikroorganizmi. To se obično radi autoklaviranjem ili sterilizacijom filtriranjem.
• Aseptičke tehnike: Sve operacije koje uključuju otvaranje bioreaktora ili unošenje materijala u fermentacijsku juhu moraju se izvoditi koristeći aseptičke tehnike. To uključuje korištenje sterilne opreme, nošenje sterilnih rukavica i rad u čistom okruženju.
• Filtracija zraka: Zrak koji ulazi u bioreaktor mora se filtrirati kroz sterilne filtere kako bi se uklonili svi mikroorganizmi iz zraka.
• Zatvoreni sustavi: Korištenje zatvorenih sustava minimizira rizik od kontaminacije. To uključuje spajanje sve opreme i cjevovoda u zatvorenu petlju i izbjegavanje otvorenih prijenosa materijala.

5. Kontrola pjene

Stvaranje pjene je čest problem u procesima fermentacije, posebno onima koji uključuju proteine ili surfaktante. Prekomjerna pjena može dovesti do smanjenog prijenosa kisika, kontaminacije i gubitka proizvoda. Pjena se može kontrolirati dodavanjem sredstava protiv pjenjenja ili korištenjem mehaničkih razbijača pjene.

• Sredstva protiv pjenjenja: Sredstva protiv pjenjenja su kemikalije koje smanjuju površinsku napetost fermentacijske juhe, sprječavajući stvaranje pjene. Uobičajena sredstva protiv pjenjenja uključuju silikone, biljna ulja i masne kiseline. Izbor sredstva protiv pjenjenja ovisi o specifičnom procesu fermentacije i osjetljivosti mikroorganizma.
• Mehanički razbijači pjene: Mehanički razbijači pjene koriste rotirajuće lopatice ili druge uređaje za fizičko razbijanje pjene. Često se koriste u kombinaciji sa sredstvima protiv pjenjenja.

Strategije za uspješno povećanje opsega

1. Pristup QbD (Kvaliteta kroz dizajn)

QbD je sustavan pristup razvoju koji započinje s unaprijed definiranim ciljevima i naglašava razumijevanje proizvoda i procesa te kontrolu procesa. Primjena načela QbD na povećanje opsega fermentacije pomaže osigurati dosljednu kvalitetu i performanse proizvoda.

Ključni elementi QbD-a uključuju:

• Definiranje ciljanog profila kvalitete proizvoda (QTPP): QTPP opisuje željene karakteristike konačnog proizvoda, kao što su čistoća, potentnost i stabilnost.
• Identificiranje ključnih atributa kvalitete (CQA): CQA su fizička, kemijska, biološka ili mikrobiološka svojstva koja se moraju kontrolirati kako bi se osigurala željena kvaliteta proizvoda.
• Identificiranje ključnih procesnih parametara (CPP): CPP su procesni parametri koji mogu utjecati na CQA.
• Uspostavljanje projektnog prostora: Projektni prostor je višedimenzionalna kombinacija i interakcija ulaznih varijabli (npr. CPP) i procesnih parametara za koje je dokazano da osiguravaju kvalitetu. Rad unutar projektnog prostora osigurava da proizvod zadovoljava željene atribute kvalitete.
• Implementacija kontrolne strategije: Kontrolna strategija opisuje kako će se CPP-ovi nadzirati i kontrolirati kako bi se osiguralo da proces ostane unutar projektnog prostora i da proizvod zadovoljava željene atribute kvalitete.

2. Računalna dinamika fluida (CFD)

CFD je moćan alat za simulaciju protoka fluida, prijenosa topline i prijenosa mase u bioreaktorima. CFD simulacije mogu se koristiti za optimizaciju dizajna bioreaktora, sustava miješanja i sustava upuhivanja. Također mogu pomoći u identificiranju potencijalnih problema kao što su mrtve zone i točke visokog smičnog naprezanja. CFD može smanjiti broj skupih i dugotrajnih eksperimenata na pilot-skali potrebnih za povećanje opsega.

3. Modeli smanjenog mjerila

Modeli smanjenog mjerila su bioreaktori malih dimenzija dizajnirani da oponašaju uvjete u velikim proizvodnim bioreaktorima. Modeli smanjenog mjerila mogu se koristiti za proučavanje učinaka različitih procesnih parametara na rast stanica, stvaranje proizvoda i kvalitetu proizvoda. Također se mogu koristiti za rješavanje problema koji se javljaju tijekom povećanja opsega. Dobro karakterizirani modeli smanjenog mjerila mogu pružiti vrijedne uvide i ubrzati proces razvoja.

4. Modeliranje i simulacija procesa

Modeliranje i simulacija procesa mogu se koristiti za predviđanje ponašanja procesa fermentacije na različitim skalama i pod različitim radnim uvjetima. Matematički modeli mogu se razviti na temelju temeljnih principa prijenosa mase, prijenosa topline i kinetike reakcija. Ti se modeli mogu koristiti za optimizaciju procesnih parametara, dizajniranje kontrolnih strategija i rješavanje problema. Alati poput MATLAB-a, gPROMS-a i Aspen Plus-a mogu se koristiti za modeliranje i simulaciju procesa.

Razmatranja o nizvodnoj obradi

Razmatranja o povećanju opsega nadilaze sam proces fermentacije. Nizvodna obrada, koja uključuje odvajanje i pročišćavanje proizvoda iz fermentacijske juhe, također se mora povećati. Izbor tehnika nizvodne obrade ovisi o prirodi proizvoda, njegovoj koncentraciji i željenoj čistoći. Uobičajene tehnike nizvodne obrade uključuju:

• Odvajanje stanica: Uklanjanje stanica iz fermentacijske juhe često je prvi korak u nizvodnoj obradi. To se može učiniti centrifugiranjem, filtracijom ili mikrofiltracijom.
• Razbijanje stanica: Ako je proizvod unutarstanični, stanice se moraju razbiti kako bi se oslobodio proizvod. To se može učiniti mehaničkim metodama (npr. homogenizacija, mljevenje kuglicama) ili kemijskim metodama (npr. enzimska liza).
• Izolacija proizvoda: Proizvod se može izolirati iz fermentacijske juhe različitim tehnikama, uključujući taloženje, ekstrakciju i adsorpciju.
• Pročišćavanje proizvoda: Proizvod se obično pročišćava kromatografskim tehnikama, kao što su afinitetna kromatografija, ionsko-izmjenjivačka kromatografija i kromatografija isključenjem po veličini.
• Formulacija proizvoda: Završni korak u nizvodnoj obradi je formuliranje proizvoda u stabilan i upotrebljiv oblik. To može uključivati dodavanje ekscipijenata, stabilizatora i konzervansa.

Globalni primjeri uspješnog povećanja opsega fermentacije

Nekoliko industrija diljem svijeta uvelike se oslanja na uspješno povećanje opsega fermentacije. Evo nekoliko primjera:

• Farmaceutska industrija (Globalno): Proizvodnja antibiotika, cjepiva i drugih biofarmaceutika oslanja se na fermentaciju velikih razmjera mikroorganizama ili staničnih kultura. Tvrtke poput Pfizera, Rochea i Novartisa upravljaju masivnim fermentacijskim postrojenjima širom svijeta.
• Prehrambena industrija i industrija pića (Europa, Sjeverna Amerika, Azija): Proizvodnja piva, vina, jogurta, sira i drugih fermentiranih namirnica i pića oslanja se na kontrolirane procese fermentacije. Tvrtke poput Anheuser-Busch InBev (Belgija), Danone (Francuska) i Kirin Brewery (Japan) usavršile su povećanje opsega fermentacije tijekom mnogo godina.
• Industrija biogoriva (Brazil, SAD): Proizvodnja etanola iz šećerne trske (Brazil) i kukuruza (SAD) uključuje fermentaciju šećera kvascem velikih razmjera. Tvrtke poput Raizena (Brazil) i Archer Daniels Midlanda (SAD) upravljaju postrojenjima za proizvodnju biogoriva velikih razmjera.
• Industrijska biotehnologija (Danska, Njemačka, Kina): Proizvodnja enzima, bioplastike i drugih proizvoda na biološkoj bazi oslanja se na fermentaciju genetski modificiranih mikroorganizama. Tvrtke poput Novozymesa (Danska), BASF-a (Njemačka) i Amyrisa (SAD) vodeće su u ovom području.

Rješavanje uobičajenih problema pri povećanju opsega

Unatoč pažljivom planiranju i izvođenju, problemi se i dalje mogu pojaviti tijekom povećanja opsega fermentacije. Evo nekih uobičajenih problema i mogućih rješenja:

• Smanjeni prinos proizvoda: To može biti posljedica promjena u metaboličkim putovima, ograničenja hranjivih tvari ili nakupljanja inhibitornih nusprodukata. Pregledajte sastav medija, optimizirajte strategije hranjenja i osigurajte adekvatan prijenos kisika.
• Povećani rizik od kontaminacije: To može biti posljedica neadekvatnih postupaka sterilizacije ili kršenja aseptičke tehnike. Pregledajte protokole sterilizacije, poboljšajte filtraciju zraka i implementirajte strože aseptičke postupke.
• Prekomjerno stvaranje pjene: To može biti posljedica promjena u sastavu medija ili fiziologiji stanica. Optimizirajte dodavanje sredstva protiv pjenjenja ili instalirajte mehanički razbijač pjene.
• Promjene u morfologiji stanica: To može biti posljedica promjena u smičnom naprezanju ili gradijentima hranjivih tvari. Optimizirajte dizajn impelera, brzinu miješanja i strategije hranjenja.
• Nestabilnost proizvoda: To može biti posljedica promjena pH, temperature ili prisutnosti razgrađujućih enzima. Optimizirajte procesne parametre i dodajte stabilizatore u medij.

Budući trendovi u povećanju opsega fermentacije

Područje fermentacije neprestano se razvija. Neki od ključnih trendova koji oblikuju budućnost povećanja opsega fermentacije uključuju:

• Kontinuirana fermentacija: Kontinuirana fermentacija nudi nekoliko prednosti u odnosu na šaržnu fermentaciju, uključujući veću produktivnost, niže operativne troškove i dosljedniju kvalitetu proizvoda.
• Jednokratni bioreaktori: Jednokratni bioreaktori eliminiraju potrebu za čišćenjem i sterilizacijom, smanjujući rizik od kontaminacije i pojednostavljujući operacije.
• Napredna kontrola procesa: Napredne tehnike kontrole procesa, kao što su modelno prediktivno upravljanje (MPC) i strojno učenje, koriste se za optimizaciju procesa fermentacije u stvarnom vremenu.
• Sintetička biologija: Sintetička biologija koristi se za inženjering mikroorganizama s poboljšanim metaboličkim sposobnostima i produktivnošću.
• Mikrobne zajednice: Iskorištavanje mikrobnih zajednica i konzorcija može otključati nove metaboličke putove i poboljšati učinkovitost bioprocesa.

Zaključak

Povećanje opsega komercijalnih procesa fermentacije složen je, ali ključan korak u plasiranju bioproizvoda na tržište. Pažljivim razmatranjem ključnih čimbenika o kojima se govori u ovom vodiču, uključujući dizajn bioreaktora, optimizaciju procesa, nadzor i kontrolu, osiguranje sterilnosti i kontrolu pjene, tvrtke mogu uspješno povećati opseg svojih procesa fermentacije i postići dosljednu kvalitetu i performanse proizvoda. Prihvaćanje novih tehnologija i metodologija, kao što su QbD, CFD, modeli smanjenog mjerila i napredna kontrola procesa, dodatno će poboljšati učinkovitost i robusnost komercijalnih fermentacijskih operacija diljem svijeta.