Věda o downstream processingu: Komplexní průvodce

Downstream processing (DSP) je kritickou fází biovýroby, která zahrnuje všechny jednotkové operace potřebné k izolaci a purifikaci sledovaného produktu ze složité biologické směsi. Tento proces následuje po upstream processingu (USP), kde je produkt vytvářen prostřednictvím buněčné kultury nebo fermentace. Účinnost a efektivita DSP přímo ovlivňuje výtěžek produktu, jeho čistotu a v konečném důsledku komerční životaschopnost biofarmak, enzymů, biopaliv a dalších bioproduktů.

Porozumění základům downstream processingu

DSP zahrnuje řadu kroků navržených k oddělení požadovaného produktu od buněčných zbytků, složek média a dalších nečistot. Tyto kroky jsou často uspořádány do sekvence, která postupně koncentruje a purifikuje cílovou molekulu. Konkrétní kroky používané v DSP se liší v závislosti na povaze produktu, rozsahu výroby a požadované úrovni čistoty.

Klíčové cíle downstream processingu:

• Izolace: Oddělení produktu od hlavní části fermentačního bujónu nebo buněčné kultury.
• Purifikace: Odstranění nežádoucích kontaminantů, jako jsou proteiny hostitelské buňky (HCPs), DNA, endotoxiny a složky média.
• Koncentrace: Zvýšení koncentrace produktu na požadovanou úroveň pro formulaci a finální použití.
• Formulace: Příprava purifikovaného produktu do stabilní a použitelné formy.

Běžné techniky downstream processingu

V DSP se používá široká škála technik, z nichž každá nabízí jedinečné výhody pro specifické výzvy v oblasti separace a purifikace.

1. Narušení buněk (buněčná disrupce)

U produktů umístěných intracelulárně je prvním krokem narušení buněk za účelem uvolnění produktu. Běžné metody narušení buněk zahrnují:

• Mechanická lýza: Použití vysokotlakých homogenizátorů, kulových mlýnů nebo sonikace k fyzickému rozbití buněk. Například při výrobě rekombinantních proteinů v *E. coli* se často používá homogenizace k uvolnění proteinu z buněk. V některých velkokapacitních provozech může pracovat několik homogenizátorů paralelně za účelem zpracování velkých objemů.
• Chemická lýza: Využití detergentů, rozpouštědel nebo enzymů k narušení buněčné membrány. Tato metoda se často používá pro citlivější produkty, kde by drsné mechanické metody mohly způsobit degradaci.
• Enzymatická lýza: Použití enzymů jako lysozym k rozkladu buněčné stěny. Běžně se používá u bakteriálních buněk a představuje šetrnější přístup než mechanické metody.

2. Separace pevných a kapalných látek

Po narušení buněk je klíčová separace pevných a kapalných látek k odstranění buněčných zbytků a dalších pevných částic. Běžné metody zahrnují:

• Centrifugace: Použití odstředivé síly k oddělení pevných látek od kapalin na základě rozdílů v hustotě. Tato metoda je široce používána ve velkoobjemových bioprocesech díky své vysoké průchodnosti a účinnosti. Různé typy centrifug, jako jsou diskové odstředivky, se používají v závislosti na objemu a vlastnostech vstupního proudu.
• Mikrofiltrace: Použití membrán s velikostí pórů v rozmezí od 0,1 do 10 μm k odstranění bakterií, buněčných zbytků a dalších pevných částic. Mikrofiltrace se často používá jako krok předběžného ošetření před ultrafiltrací nebo chromatografií.
• Hloubková filtrace: Použití porézní matrice k zachycení pevných částic při průchodu kapaliny. Hloubkové filtry se často používají k čiření bujónů z buněčných kultur s vysokou hustotou buněk.

3. Chromatografie

Chromatografie je výkonná separační technika, která využívá rozdílů ve fyzikálních a chemických vlastnostech molekul k dosažení purifikace s vysokým rozlišením. V DSP se běžně používá několik typů chromatografie:

• Afinitní chromatografie: Využívá specifických vazebných interakcí mezi cílovou molekulou a ligandem imobilizovaným na pevném nosiči. Jedná se o vysoce selektivní metodu, která se často používá jako počáteční purifikační krok. Například afinitní chromatografie s His-tagem se široce používá k purifikaci rekombinantních proteinů obsahujících polyhistidinový tag.
• Iontově-výměnná chromatografie (IEX): Separuje molekuly na základě jejich čistého náboje. Katexová chromatografie se používá k vazbě kladně nabitých molekul, zatímco anexová chromatografie váže záporně nabité molekuly. IEX se běžně používá k purifikaci proteinů, peptidů a nukleových kyselin.
• Velikostně-exkluzní chromatografie (SEC): Separuje molekuly na základě jejich velikosti. Tato metoda se často používá pro finální "lešticí" kroky k odstranění agregátů nebo fragmentů cílové molekuly.
• Hydrofobní interakční chromatografie (HIC): Separuje molekuly na základě jejich hydrofobicity. HIC se často používá k purifikaci proteinů, které jsou citlivé na denaturaci.
• Multimodální chromatografie: Kombinuje více interakčních mechanismů pro zvýšení selektivity a účinnosti purifikace.

4. Membránová filtrace

Techniky membránové filtrace se používají pro koncentraci, diafiltraci a výměnu pufru.

• Ultrafiltrace (UF): Použití membrán s velikostí pórů v rozmezí od 1 do 100 nm ke koncentraci produktu a odstranění nečistot s nízkou molekulovou hmotností. UF se široce používá ke koncentraci proteinů, protilátek a dalších biomolekul.
• Diafiltrace (DF): Použití UF membrán k odstranění solí, rozpouštědel a dalších malých molekul z roztoku produktu. DF se často používá pro výměnu pufru a odsolování.
• Nanofiltrace (NF): Použití membrán s velikostí pórů menší než 1 nm k odstranění dvojmocných iontů a dalších malých nabitých molekul.
• Reverzní osmóza (RO): Použití membrán s extrémně malými póry k odstranění prakticky všech rozpuštěných látek z vody. RO se používá k čištění vody a koncentraci vysoce koncentrovaných roztoků.

5. Srážení

Srážení zahrnuje přidání činidla do roztoku ke snížení rozpustnosti cílové molekuly, což způsobí její vysrážení z roztoku. Běžná srážecí činidla zahrnují:

• Síran amonný: Široce používané srážecí činidlo, které může selektivně srážet proteiny na základě jejich hydrofobicity.
• Organická rozpouštědla: Jako je ethanol nebo aceton, které mohou snížit rozpustnost proteinů změnou dielektrické konstanty roztoku.
• Polymery: Jako je polyethylenglykol (PEG), které mohou vyvolat srážení vytěsněním molekul proteinu.

6. Virová clearance

U biofarmaceutických produktů je virová clearance kritickým bezpečnostním požadavkem. Strategie virové clearance obvykle zahrnují kombinaci:

• Virová filtrace: Použití filtrů s dostatečně malými póry k fyzickému odstranění virů.
• Virová inaktivace: Použití chemických nebo fyzikálních metod k inaktivaci virů. Běžné metody zahrnují ošetření nízkým pH, tepelné ošetření a UV záření.

Výzvy v downstream processingu

DSP může být složitý a náročný proces kvůli několika faktorům:

• Nestabilita produktu: Mnoho biomolekul je citlivých na teplotu, pH a smykové síly, což vyžaduje pečlivou kontrolu procesních podmínek, aby se zabránilo degradaci.
• Nízká koncentrace produktu: Koncentrace cílové molekuly ve fermentačním bujónu nebo buněčné kultuře je často nízká, což vyžaduje významné kroky koncentrace.
• Složité směsi: Přítomnost četných nečistot, jako jsou proteiny hostitelské buňky, DNA a endotoxiny, může ztížit dosažení vysoké čistoty.
• Vysoké náklady: DSP může být drahý kvůli nákladům na vybavení, spotřební materiál a práci.
• Regulatorní požadavky: Biofarmaceutické produkty podléhají přísným regulatorním požadavkům, což vyžaduje rozsáhlou validaci procesů a kontrolu kvality.

Strategie pro optimalizaci downstream processingu

K optimalizaci DSP a zlepšení výtěžku a čistoty produktu lze použít několik strategií:

• Intenzifikace procesů: Implementace strategií ke zvýšení průchodnosti a účinnosti operací DSP, jako je kontinuální chromatografie a integrovaný návrh procesů.
• Procesní analytická technologie (PAT): Použití monitorování a řízení v reálném čase k optimalizaci procesních parametrů a zajištění konzistentní kvality produktu. Nástroje PAT mohou zahrnovat online senzory pro pH, teplotu, vodivost a koncentraci proteinů.
• Technologie na jedno použití: Použití jednorázového vybavení ke snížení požadavků na validaci čištění a minimalizaci rizika křížové kontaminace. Jednorázové bioreaktory, filtry a chromatografické kolony jsou v biovýrobě stále populárnější.
• Modelování a simulace: Použití matematických modelů k predikci výkonu procesu a optimalizaci procesních parametrů. Výpočetní dynamika tekutin (CFD) může být použita k optimalizaci míchání a přenosu hmoty v bioreaktorech a dalším procesním zařízení.
• Automatizace: Automatizace operací DSP ke snížení manuální práce a zlepšení konzistence procesů. Automatizované chromatografické systémy a roboty pro manipulaci s kapalinami jsou v biovýrobě široce používány.

Příklady downstream processingu v různých průmyslových odvětvích

Principy DSP se uplatňují v různých průmyslových odvětvích:

• Biofarmaceutika: Výroba monoklonálních protilátek, rekombinantních proteinů, vakcín a genových terapií. Například výroba inzulínu zahrnuje několik kroků DSP, včetně lýzy buněk, chromatografie a ultrafiltrace.
• Enzymy: Výroba průmyslových enzymů pro použití při zpracování potravin, v detergentech a biopalivech. V potravinářském průmyslu se enzymy jako amyláza a proteáza vyrábějí fermentací a následně purifikují pomocí technik downstream processingu.
• Potraviny a nápoje: Výroba potravinářských aditiv, ochucovadel a přísad. Například extrakce a purifikace kyseliny citronové z fermentačních bujónů zahrnuje techniky DSP, jako je srážení a filtrace.
• Biopaliva: Výroba ethanolu, bionafty a dalších biopaliv z obnovitelných zdrojů. Výroba ethanolu z kukuřice zahrnuje fermentaci následovanou destilací a dehydratací za účelem purifikace ethanolu.

Nové trendy v downstream processingu

Oblast DSP se neustále vyvíjí a jsou vyvíjeny nové technologie a přístupy k řešení výzev biovýroby. Mezi nové trendy patří:

• Kontinuální výroba: Implementace kontinuálních procesů pro zlepšení účinnosti a snížení nákladů. Kontinuální chromatografie a kontinuální průtokové reaktory jsou přijímány pro velkoobjemovou biovýrobu.
• Integrovaný bioprocessing: Kombinace operací USP a DSP do jediného, integrovaného procesu za účelem minimalizace manuální manipulace a zlepšení řízení procesu.
• Pokročilé chromatografické techniky: Vývoj nových chromatografických pryskyřic a metod pro zlepšení selektivity a rozlišení.
• Umělá inteligence a strojové učení: Použití AI a ML k optimalizaci procesů DSP a predikci výkonu procesu. Algoritmy strojového učení mohou být použity k analýze velkých datových sad a identifikaci optimálních procesních parametrů.
• 3D tisk: Použití 3D tisku k vytváření na míru navržených separačních zařízení a chromatografických kolon.

Budoucnost downstream processingu

Budoucnost DSP bude poháněna potřebou efektivnějších, nákladově výhodnějších a udržitelnějších biovýrobních procesů. Vývoj nových technologií a přístupů, jako je kontinuální výroba, integrovaný bioprocessing a optimalizace procesů řízená umělou inteligencí, bude hrát klíčovou roli při plnění této potřeby.

Závěr

Downstream processing je kritickou součástí biovýroby a hraje zásadní roli při výrobě široké škály bioproduktů. Porozuměním principům a technikám DSP a přijetím inovativních strategií pro optimalizaci procesů mohou výrobci zlepšit výtěžek produktu, jeho čistotu a v konečném důsledku komerční životaschopnost svých produktů. Probíhající pokroky v technologiích DSP slibují další zvýšení účinnosti a udržitelnosti biovýroby v nadcházejících letech. Od velkých farmaceutických společností po menší biotechnologické startupy je porozumění vědě o downstream processingu pro úspěch v bioprocesním průmyslu prvořadé.