Zvětšování měřítka: Komplexní průvodce komerční fermentací

Fermentace je základním kamenem mnoha průmyslových odvětví, od potravinářství a nápojářství až po farmacii a biopaliva. Zatímco úspěšná fermentace v laboratorním měřítku je významným úspěchem, přenesení tohoto úspěchu do komerční výroby vyžaduje pečlivé plánování, provedení a optimalizaci. Tento průvodce poskytuje komplexní přehled klíčových aspektů a osvědčených postupů pro zvětšování měřítka komerčních fermentačních procesů.

Proč je zvětšování měřítka fermentace náročné?

Zvětšení měřítka fermentačního procesu není jen o navýšení objemu. Několik faktorů, které lze snadno kontrolovat v malém měřítku, se s růstem procesu stává výrazně složitějšími. Mezi ně patří:

• Přenos tepla: Udržování optimální teploty je klíčové pro růst mikrobů a tvorbu produktu. Větší bioreaktory mají menší poměr povrchu k objemu, což ztěžuje odvod tepla. Nedostatečné chlazení může vést k přehřátí a odumření buněk, zatímco nadměrné chlazení může zpomalit fermentační proces.
• Přenos hmoty: Přenos kyslíku je často limitujícím faktorem v aerobních fermentacích. S rostoucí hustotou kultury stoupá i poptávka po kyslíku. Zajištění dostatečného přísunu kyslíku v celém bioreaktoru se ve větších měřítkách stává stále obtížnějším. Míchání, provzdušňování a design reaktoru hrají klíčovou roli v účinnosti přenosu kyslíku.
• Míchání: Účinné míchání je nezbytné pro udržení homogenity, distribuci živin a odstraňování metabolických vedlejších produktů. Špatné míchání může vést ke gradientům pH, teploty a koncentrace živin, což může negativně ovlivnit růst buněk a tvorbu produktu. Je třeba pečlivě zvážit typ a konfiguraci míchadel, design přepážek a rychlost míchání.
• Smykové napětí: Nadměrné smykové napětí od míchadel může poškodit buňky, zejména ty, které jsou citlivé na smyk. Optimalizace designu míchadla a rychlosti míchání je klíčová pro minimalizaci smykového napětí při zachování adekvátního míchání. Některé buňky (např. vláknité houby) jsou náchylnější k poškození smykem než jiné.
• Sterilita: Udržování sterility je ve fermentačních procesech prvořadé. Riziko kontaminace se zvyšuje s velikostí a složitostí bioreaktoru. Robustní sterilizační postupy, aseptické techniky a uzavřené systémy jsou nezbytné k prevenci kontaminace a zajištění kvality produktu.
• Kontrola pH: Udržování optimálního rozsahu pH je klíčové pro aktivitu enzymů a životaschopnost buněk. Během fermentace může produkce kyselin nebo zásad způsobit výrazné kolísání pH. Přesná kontrola pH vyžaduje sofistikované monitorovací a řídicí systémy.
• Monitorování a řízení procesu: Efektivní monitorování a řízení kritických parametrů procesu (např. teplota, pH, rozpuštěný kyslík, hladiny živin) je klíčové pro konzistentní výkon a kvalitu produktu. Monitorování v reálném čase a automatizované řídicí systémy jsou pro velkoobjemové fermentace nezbytné.
• Metabolické změny závislé na měřítku: Buňky se mohou ve velkoobjemových fermentorech chovat odlišně než v malých kulturách. Faktory jako dostupnost kyslíku, smykové napětí a gradienty živin mohou měnit metabolické dráhy a ovlivňovat výtěžek a kvalitu produktu. Tyto změny je třeba během zvětšování měřítka pečlivě studovat a řešit.

Fáze zvětšování měřítka fermentace

Proces zvětšování měřítka obvykle zahrnuje několik fází, z nichž každá má své vlastní cíle a výzvy:

1. Vývoj očkovací kultury

Očkovací kultura slouží jako inokulum pro produkční fermentor. Je klíčové vyvinout očkovací kulturu, která je zdravá, aktivně rostoucí a bez kontaminace. To obvykle zahrnuje několik fází růstu, počínaje kryoprezervovanou zásobní kulturou a postupující přes třepací baňky, malé bioreaktory a nakonec do očkovacího fermentoru. Očkovací kultura by měla být fyziologicky podobná buňkám požadovaným v produkčním fermentoru.

Příklad: Farmaceutická společnost vyvíjející nové antibiotikum může začít se zmrazenou zásobou produkujícího mikroorganismu. Tato zásoba se oživí v třepací baňce, poté se přenese do malého (např. 2L) bioreaktoru. Biomasa z tohoto bioreaktoru pak naočkuje větší (např. 50L) očkovací fermentor, který poskytne inokulum pro produkční fermentor.

2. Pilotní fermentace

Pilotní fermentace překlenuje mezeru mezi laboratoří a průmyslovou výrobou. Umožňuje testovat a optimalizovat fermentační proces v podmínkách, které se více podobají plnohodnotnému výrobnímu prostředí. Pilotní studie pomáhají identifikovat potenciální problémy se zvětšováním měřítka a upřesnit provozní parametry. Tyto experimenty obvykle zahrnují bioreaktory o objemu od 50L do 500L.

Příklad: Společnost vyrábějící biopaliva může použít 100L bioreaktor k hodnocení výkonu nového geneticky modifikovaného kmene kvasinek pro produkci etanolu. Optimalizovali by parametry jako teplota, pH a rychlost přítoku živin pro maximalizaci výtěžku a produktivity etanolu.

3. Produkční fermentace

Poslední fází je produkční fermentace, kde se produkt vyrábí ve velkém množství pro komerční prodej. Produkční bioreaktory mohou mít objem od několika tisíc litrů až po stovky tisíc litrů. Udržování konzistentního výkonu a kvality produktu v tomto měřítku vyžaduje pečlivou pozornost k detailům a robustní systémy řízení procesu.

Příklad: Pivovar může použít 10 000L fermentor k výrobě piva v komerčním měřítku. Pečlivě by sledovali teplotu, pH a hladinu rozpuštěného kyslíku, aby zajistili konzistentní chuť a kvalitu.

Klíčové aspekty pro zvětšování měřítka fermentace

1. Design bioreaktoru

Bioreaktor je srdcem fermentačního procesu. Výběr správného designu bioreaktoru je klíčový pro úspěšné zvětšení měřítka. Klíčové aspekty zahrnují:

• Typ bioreaktoru: Různé typy bioreaktorů jsou vhodné pro různé aplikace. Míchané tankové reaktory jsou nejběžnějším typem, ale další možnosti zahrnují air-lift reaktory, probublávané kolonové reaktory a reaktory s pevným ložem. Volba závisí na specifických požadavcích fermentačního procesu, jako je typ mikroorganismu, poptávka po kyslíku a citlivost na smykové napětí.
• Míchací systém: Míchací systém musí zajistit adekvátní míchání pro homogenitu, distribuci živin a přenos kyslíku. Běžné typy míchadel zahrnují Rushtonovy turbíny, turbíny se šikmými lopatkami a lodní šrouby. Počet a konfigurace míchadel, design přepážek a rychlost míchání musí být optimalizovány pro konkrétní bioreaktor a fermentační proces.
• Provzdušňovací systém: Provzdušňovací systém přivádí vzduch nebo kyslík do bioreaktoru. Typ a velikost provzdušňovače, průtok plynu a složení plynu musí být pečlivě kontrolovány, aby se optimalizoval přenos kyslíku bez způsobení nadměrného pěnění nebo poškození buněk.
• Systém přenosu tepla: Systém přenosu tepla musí udržovat bioreaktor na optimální teplotě pro růst buněk a tvorbu produktu. Obvykle se jedná o plášťovou nádobu s cirkulující chladicí nebo topnou kapalinou. Kapacita přenosu tepla musí být dostatečná k odvedení tepla generovaného fermentačním procesem.
• Instrumentace a řízení: Bioreaktor musí být vybaven senzory a řídicími systémy pro monitorování a regulaci kritických parametrů procesu, jako je teplota, pH, rozpuštěný kyslík a hladiny živin. Automatizované řídicí systémy jsou nezbytné pro udržení konzistentního výkonu a kvality produktu.

2. Optimalizace procesu

Optimalizace procesu zahrnuje identifikaci a optimalizaci klíčových parametrů procesu, které ovlivňují růst buněk, tvorbu produktu a kvalitu produktu. Obvykle se jedná o kombinaci experimentálních studií a matematického modelování.

• Optimalizace média: Fermentační médium musí poskytovat všechny živiny potřebné pro růst buněk a tvorbu produktu. Optimalizace složení média může výrazně zlepšit výtěžek a produktivitu produktu. To může zahrnovat změnu koncentrací zdrojů uhlíku, zdrojů dusíku, vitamínů a minerálů. K efektivní optimalizaci složení média lze použít statistické experimentální návrhy, jako je metodologie povrchu odezvy (RSM).
• Optimalizace teploty: Optimální teplota pro růst buněk a tvorbu produktu závisí na konkrétním mikroorganismu. Teplota může ovlivnit aktivitu enzymů, fluiditu membrán a stabilitu proteinů. Optimální teplota by měla být stanovena experimentálně.
• Optimalizace pH: Optimální rozsah pH pro růst buněk a tvorbu produktu také závisí na konkrétním mikroorganismu. pH může ovlivnit aktivitu enzymů, permeabilitu buněčné membrány a rozpustnost proteinů. Přesná kontrola pH je nezbytná pro optimální výkon fermentace.
• Optimalizace rozpuštěného kyslíku: Udržování adekvátních hladin rozpuštěného kyslíku je klíčové pro aerobní fermentace. Optimální hladina rozpuštěného kyslíku závisí na poptávce mikroorganismu po kyslíku a kapacitě přenosu kyslíku v bioreaktoru. Hladiny rozpuštěného kyslíku lze regulovat úpravou rychlosti míchání, rychlosti aerace a obohacení kyslíkem.
• Strategie přítoku: U fed-batch a kontinuálních fermentací musí být rychlost a složení přítoku pečlivě optimalizovány, aby se maximalizoval výtěžek a produktivita produktu. Lze použít strategie řízení se zpětnou vazbou k úpravě rychlosti přítoku na základě měření koncentrace glukózy, pH nebo rozpuštěného kyslíku v reálném čase.

3. Monitorování a řízení

Efektivní monitorování a řízení kritických parametrů procesu je nezbytné pro konzistentní výkon a kvalitu produktu. To vyžaduje použití vhodných senzorů, řídicích systémů a technik analýzy dat.

• Senzory: K dispozici jsou různé senzory pro monitorování kritických parametrů procesu, včetně teploty, pH, rozpuštěného kyslíku, koncentrace glukózy, koncentrace biomasy a koncentrace produktu. Volba senzoru závisí na konkrétním měřeném parametru a požadavcích fermentačního procesu.
• Řídicí systémy: Automatizované řídicí systémy se používají k regulaci parametrů procesu na základě zpětné vazby ze senzorů. Běžné řídicí systémy zahrnují PID (proporcionálně-integračně-derivační) regulátory, které upravují manipulované proměnné (např. teplota, pH, rychlost míchání) tak, aby udržely požadované nastavené hodnoty.
• Analýza dat: Data shromážděná ze senzorů a řídicích systémů lze analyzovat k identifikaci trendů, detekci anomálií a optimalizaci výkonu procesu. Techniky statistického řízení procesu (SPC) lze použít k monitorování variability procesu a identifikaci potenciálních problémů dříve, než ovlivní kvalitu produktu.
• Procesní analytická technologie (PAT): PAT je rámec pro navrhování, analýzu a řízení výrobních procesů prostřednictvím včasných měření kritických atributů kvality (CQA) a kritických parametrů procesu (CPP). Cílem PAT je zlepšit porozumění procesu, snížit variabilitu a zvýšit kvalitu produktu.

4. Zajištění sterility

Udržování sterility je ve fermentačních procesech prvořadé. Kontaminace může vést ke znehodnocení produktu, snížení výtěžku a dokonce k úplnému selhání procesu. Implementace robustních sterilizačních postupů a aseptických technik je nezbytná.

• Sterilizace zařízení: Všechna zařízení, která přicházejí do styku s fermentačním bujónem, včetně bioreaktoru, potrubí a senzorů, musí být před použitím důkladně sterilizována. Sterilizace párou je nejběžnější metodou, ale další možnosti zahrnují autoklávování, filtraci a chemickou sterilizaci.
• Sterilizace médií: Fermentační médium musí být také sterilizováno, aby se eliminovaly veškeré kontaminující mikroorganismy. To se obvykle provádí autoklávováním nebo sterilní filtrací.
• Aseptické techniky: Všechny operace, které zahrnují otevření bioreaktoru nebo zavedení materiálů do fermentačního bujónu, musí být prováděny pomocí aseptických technik. To zahrnuje používání sterilního vybavení, nošení sterilních rukavic a práci v čistém prostředí.
• Filtrace vzduchu: Vzduch vstupující do bioreaktoru musí být filtrován přes sterilní filtry, aby se odstranily veškeré vzduchem přenášené mikroorganismy.
• Uzavřené systémy: Použití uzavřených systémů minimalizuje riziko kontaminace. To zahrnuje propojení veškerého vybavení a potrubí v uzavřeném okruhu a vyhýbání se jakýmkoli otevřeným přenosům materiálů.

5. Kontrola pěny

Tvorba pěny je běžným problémem ve fermentačních procesech, zejména těch, které zahrnují proteiny nebo povrchově aktivní látky. Nadměrná pěna může vést ke snížení přenosu kyslíku, kontaminaci a ztrátě produktu. Pěnu lze kontrolovat přidáváním protipěnivých činidel nebo použitím mechanických rozbíječů pěny.

• Protipěnivá činidla: Protipěnivá činidla jsou chemikálie, které snižují povrchové napětí fermentačního bujónu a zabraňují tvorbě pěny. Běžná protipěnivá činidla zahrnují silikony, rostlinné oleje a mastné kyseliny. Volba protipěnivého činidla závisí na konkrétním fermentačním procesu a citlivosti mikroorganismu.
• Mechanické rozbíječe pěny: Mechanické rozbíječe pěny používají rotující lopatky nebo jiná zařízení k fyzickému rozbití pěny. Často se používají ve spojení s protipěnivými činidly.

Strategie pro úspěšné zvětšení měřítka

1. Přístup QbD (Kvalita prostřednictvím návrhu)

QbD je systematický přístup k vývoji, který začíná s předem definovanými cíli a klade důraz na porozumění produktu a procesu a na řízení procesu. Aplikace principů QbD na zvětšování měřítka fermentace pomáhá zajistit konzistentní kvalitu a výkon produktu.

Klíčové prvky QbD zahrnují:

• Definování cílového profilu kvality produktu (QTPP): QTPP popisuje požadované vlastnosti konečného produktu, jako je čistota, účinnost a stabilita.
• Identifikace kritických atributů kvality (CQA): CQA jsou fyzikální, chemické, biologické nebo mikrobiologické vlastnosti, které musí být kontrolovány, aby byla zajištěna požadovaná kvalita produktu.
• Identifikace kritických parametrů procesu (CPP): CPP jsou parametry procesu, které mohou ovlivnit CQA.
• Stanovení návrhového prostoru: Návrhový prostor je vícerozměrná kombinace a interakce vstupních proměnných (např. CPP) a parametrů procesu, u které bylo prokázáno, že poskytuje záruku kvality. Práce v rámci návrhového prostoru zajišťuje, že produkt splňuje požadované atributy kvality.
• Implementace kontrolní strategie: Kontrolní strategie popisuje, jak budou CPP monitorovány a kontrolovány, aby bylo zajištěno, že proces zůstane v návrhovém prostoru a že produkt bude splňovat požadované atributy kvality.

2. Výpočetní dynamika tekutin (CFD)

CFD je výkonný nástroj pro simulaci proudění tekutin, přenosu tepla a přenosu hmoty v bioreaktorech. Simulace CFD lze použít k optimalizaci designu bioreaktoru, míchacích systémů a provzdušňovacích systémů. Mohou také pomoci identifikovat potenciální problémy, jako jsou mrtvé zóny a místa s vysokým smykovým napětím. CFD může snížit počet nákladných a časově náročných pilotních experimentů potřebných pro zvětšení měřítka.

3. Modely zmenšeného měřítka (Scale-Down)

Modely zmenšeného měřítka jsou malé bioreaktory navržené tak, aby napodobovaly podmínky ve velkém produkčním bioreaktoru. Lze je použít ke studiu účinků různých parametrů procesu na růst buněk, tvorbu produktu a kvalitu produktu. Lze je také použít k řešení problémů, které vznikají během zvětšování měřítka. Dobře charakterizované modely zmenšeného měřítka mohou poskytnout cenné poznatky a urychlit proces vývoje.

4. Modelování a simulace procesů

Modelování a simulace procesů lze použít k předpovídání chování fermentačního procesu v různých měřítkách a za různých provozních podmínek. Matematické modely lze vyvinout na základě základních principů přenosu hmoty, přenosu tepla a reakční kinetiky. Tyto modely lze použít k optimalizaci parametrů procesu, návrhu kontrolních strategií a řešení problémů. Pro modelování a simulaci procesů lze použít nástroje jako MATLAB, gPROMS a Aspen Plus.

Aspekty následného zpracování (Downstream Processing)

Úvahy o zvětšování měřítka přesahují samotný fermentační proces. Je třeba také zvětšit měřítko následného zpracování, které zahrnuje separaci a čištění produktu z fermentačního bujónu. Volba technik následného zpracování závisí na povaze produktu, jeho koncentraci a požadované čistotě. Běžné techniky následného zpracování zahrnují:

• Separace buněk: Odstranění buněk z fermentačního bujónu je často prvním krokem v následném zpracování. To lze provést centrifugací, filtrací nebo mikrofiltrací.
• Rozrušení buněk: Pokud je produkt intracelulární, buňky musí být rozrušeny, aby se produkt uvolnil. To lze provést mechanickými metodami (např. homogenizace, mletí s kuličkami) nebo chemickými metodami (např. enzymatická lýza).
• Izolace produktu: Produkt lze izolovat z fermentačního bujónu pomocí různých technik, včetně srážení, extrakce a adsorpce.
• Čištění produktu: Produkt se obvykle čistí chromatografickými technikami, jako je afinitní chromatografie, iontoměničová chromatografie a velikostně-vylučovací chromatografie.
• Formulace produktu: Posledním krokem v následném zpracování je formulace produktu do stabilní a použitelné formy. To může zahrnovat přidání pomocných látek, stabilizátorů a konzervantů.

Globální příklady úspěšného zvětšení měřítka fermentace

Několik průmyslových odvětví po celém světě se silně spoléhá na úspěšné zvětšení měřítka fermentace. Zde je několik příkladů:

• Farmaceutický průmysl (globálně): Výroba antibiotik, vakcín a dalších biofarmaceutik se opírá o velkoobjemovou fermentaci mikroorganismů nebo buněčných kultur. Společnosti jako Pfizer, Roche a Novartis provozují masivní fermentační zařízení po celém světě.
• Potravinářský a nápojářský průmysl (Evropa, Severní Amerika, Asie): Výroba piva, vína, jogurtů, sýrů a dalších fermentovaných potravin a nápojů se opírá o řízené fermentační procesy. Společnosti jako Anheuser-Busch InBev (Belgie), Danone (Francie) a Kirin Brewery (Japonsko) zdokonalily zvětšování měřítka fermentace během mnoha let.
• Průmysl biopaliv (Brazílie, USA): Výroba etanolu z cukrové třtiny (Brazílie) a kukuřice (USA) zahrnuje velkoobjemovou fermentaci cukrů kvasinkami. Společnosti jako Raizen (Brazílie) a Archer Daniels Midland (USA) provozují velkoobjemová zařízení na výrobu biopaliv.
• Průmyslová biotechnologie (Dánsko, Německo, Čína): Výroba enzymů, bioplastů a dalších produktů na biologické bázi se opírá o fermentaci geneticky modifikovaných mikroorganismů. Společnosti jako Novozymes (Dánsko), BASF (Německo) a Amyris (USA) jsou lídry v této oblasti.

Řešení běžných problémů při zvětšování měřítka

I přes pečlivé plánování a provedení se mohou během zvětšování měřítka fermentace stále objevit problémy. Zde jsou některé běžné problémy a možná řešení:

• Snížený výtěžek produktu: Může to být způsobeno změnami v metabolických drahách, omezením živin nebo akumulací inhibičních vedlejších produktů. Zkontrolujte složení média, optimalizujte strategie přítoku a zajistěte adekvátní přenos kyslíku.
• Zvýšené riziko kontaminace: Může to být způsobeno nedostatečnými sterilizačními postupy nebo porušením aseptické techniky. Zkontrolujte sterilizační protokoly, zlepšete filtraci vzduchu a zaveďte přísnější aseptické postupy.
• Nadprodukce pěny: Může to být způsobeno změnami ve složení média nebo fyziologii buněk. Optimalizujte přidávání protipěnivého činidla nebo nainstalujte mechanický rozbíječ pěny.
• Změny v morfologii buněk: Může to být způsobeno změnami smykového napětí nebo gradientů živin. Optimalizujte design míchadla, rychlost míchání a strategie přítoku.
• Nestabilita produktu: Může to být způsobeno změnami pH, teploty nebo přítomností degradujících enzymů. Optimalizujte parametry procesu a přidejte do média stabilizátory.

Budoucí trendy ve zvětšování měřítka fermentace

Oblast fermentace se neustále vyvíjí. Některé z klíčových trendů, které formují budoucnost zvětšování měřítka fermentace, zahrnují:

• Kontinuální fermentace: Kontinuální fermentace nabízí několik výhod oproti dávkové fermentaci, včetně vyšší produktivity, nižších provozních nákladů a konzistentnější kvality produktu.
• Jednorázové bioreaktory: Jednorázové bioreaktory eliminují potřebu čištění a sterilizace, což snižuje riziko kontaminace a zjednodušuje operace.
• Pokročilé řízení procesů: Pokročilé techniky řízení procesů, jako je prediktivní řízení modelu (MPC) a strojové učení, se používají k optimalizaci fermentačních procesů v reálném čase.
• Syntetická biologie: Syntetická biologie se používá k inženýrství mikroorganismů se zlepšenými metabolickými schopnostmi a produktivitou.
• Mikrobiální komunity: Využití mikrobiálních komunit a konsorcií může odemknout nové metabolické dráhy a zlepšit účinnost bioprocesů.

Závěr

Zvětšování měřítka komerčních fermentačních procesů je složitý, ale nezbytný krok při uvádění bioproduktů na trh. Pečlivým zvážením klíčových faktorů diskutovaných v tomto průvodci, včetně designu bioreaktoru, optimalizace procesu, monitorování a řízení, zajištění sterility a kontroly pěny, mohou společnosti úspěšně zvětšit měřítko svých fermentačních procesů a dosáhnout konzistentní kvality a výkonu produktu. Přijetí nových technologií a metodologií, jako je QbD, CFD, modely zmenšeného měřítka a pokročilé řízení procesů, dále zvýší účinnost a robustnost komerčních fermentačních operací po celém světě.