Разширяване на мащаба: Цялостно ръководство за търговска ферментация

Ферментацията е крайъгълен камък на множество индустрии, от хранително-вкусовата промишленост до фармацевтиката и биогоривата. Въпреки че успешната ферментация в лабораторен мащаб е значително постижение, пренасянето на този успех в търговско производство изисква внимателно планиране, изпълнение и оптимизация. Това ръководство предоставя цялостен преглед на ключовите съображения и най-добрите практики за мащабиране на търговски ферментационни процеси.

Защо мащабирането на ферментацията е предизвикателство?

Мащабирането на ферментационен процес не е просто увеличаване на обема. Няколко фактора, които лесно се контролират в малък мащаб, стават значително по-сложни с нарастването на процеса. Те включват:

• Топлообмен: Поддържането на оптимална температура е от решаващо значение за микробния растеж и формирането на продукта. По-големите биореактори имат по-малко съотношение повърхност/обем, което прави отвеждането на топлината по-трудно. Неадекватното охлаждане може да доведе до прегряване и клетъчна смърт, докато прекомерното охлаждане може да забави процеса на ферментация.
• Масообмен: Преносът на кислород често е ограничаващ фактор при аеробни ферментации. С увеличаването на плътността на културата се повишава и нуждата от кислород. Осигуряването на адекватно снабдяване с кислород в целия биореактор става все по-трудно при по-големи мащаби. Разбъркването, барботирането и дизайнът на реактора играят решаваща роля за ефективността на преноса на кислород.
• Разбъркване: Ефективното разбъркване е от съществено значение за поддържане на хомогенност, разпределение на хранителни вещества и отстраняване на метаболитни странични продукти. Лошото разбъркване може да доведе до градиенти в pH, температурата и концентрацията на хранителни вещества, което може да повлияе отрицателно на клетъчния растеж и формирането на продукта. Типът и конфигурацията на бъркалките, дизайнът на преградите и скоростта на разбъркване трябва да бъдат внимателно обмислени.
• Напрежение на срязване: Прекомерното напрежение на срязване от бъркалките може да увреди клетките, особено тези, които са чувствителни на срязване. Оптимизирането на дизайна на бъркалките и скоростта на разбъркване е от решаващо значение за минимизиране на напрежението на срязване, като същевременно се поддържа адекватно разбъркване. Някои клетки (напр. нишковидни гъби) са по-податливи на увреждане от срязване от други.
• Стерилност: Поддържането на стерилност е от първостепенно значение при ферментационните процеси. Рискът от замърсяване се увеличава с размера и сложността на биореактора. Стабилните процедури за стерилизация, асептичните техники и затворените системи са от съществено значение за предотвратяване на замърсяването и осигуряване на качеството на продукта.
• Контрол на pH: Поддържането на оптималния диапазон на pH е критично за ензимната активност и клетъчната жизнеспособност. С напредването на ферментацията, производството на киселини или основи може да причини значителни колебания в pH. Прецизният контрол на pH изисква сложни системи за наблюдение и контрол.
• Мониторинг и контрол на процеса: Ефективното наблюдение и контрол на критичните параметри на процеса (напр. температура, pH, разтворен кислород, нива на хранителни вещества) е от решаващо значение за постоянната производителност и качеството на продукта. Системите за наблюдение в реално време и автоматизираните системи за контрол са от съществено значение за мащабни ферментации.
• Метаболитни промени, зависими от мащаба: Клетките могат да се държат различно в големи ферментатори в сравнение с малки култури. Фактори като наличност на кислород, напрежение на срязване и градиенти на хранителни вещества могат да променят метаболитните пътища и да повлияят на добива и качеството на продукта. Тези промени трябва да бъдат внимателно проучени и адресирани по време на мащабирането.

Етапи на мащабиране на ферментацията

Процесът на мащабиране обикновено включва няколко етапа, всеки със своите собствени цели и предизвикателства:

1. Развитие на посевната култура

Посевната култура служи като инокулум за производствения ферментатор. От решаващо значение е да се развие посевна култура, която е здрава, активно растяща и без замърсяване. Това обикновено включва множество етапи на растеж, като се започне от криоконсервирана стокова култура и се премине през колби за разклащане, малки биореактори и накрая до посевен ферментатор. Посевната култура трябва да бъде физиологично сходна с клетките, желани в производствения ферментатор.

Пример: Фармацевтична компания, разработваща нов антибиотик, може да започне със замразен запас от произвеждащия микроорганизъм. Този запас се съживява в колба за разклащане, след което се прехвърля в малък (напр. 2L) биореактор. Биомасата от този биореактор след това инокулира по-голям (напр. 50L) посевен ферментатор, който осигурява инокулума за производствения ферментатор.

2. Ферментация в пилотен мащаб

Ферментацията в пилотен мащаб преодолява пропастта между лабораторията и промишленото производство. Тя ви позволява да тествате и оптимизирате ферментационния процес при условия, които по-точно наподобяват пълномащабната производствена среда. Проучванията в пилотен мащаб помагат за идентифициране на потенциални проблеми при мащабиране и за усъвършенстване на работните параметри. Тези експерименти обикновено включват биореактори с обем от 50 до 500 литра.

Пример: Компания за биогорива може да използва 100-литров биореактор, за да оцени производителността на нов генетично модифициран щам дрожди за производство на етанол. Те ще оптимизират параметри като температура, pH и скорост на подаване на хранителни вещества, за да увеличат максимално добива и производителността на етанол.

3. Ферментация в производствен мащаб

Последният етап е ферментацията в производствен мащаб, където продуктът се произвежда в големи количества за търговска продажба. Биореакторите в производствен мащаб могат да варират от няколко хиляди литра до стотици хиляди литри. Поддържането на постоянна производителност и качество на продукта в този мащаб изисква голямо внимание към детайлите и стабилни системи за контрол на процесите.

Пример: Пивоварна може да използва 10 000-литров ферментатор за производство на бира в търговски мащаб. Те ще следят внимателно нивата на температура, pH и разтворен кислород, за да осигурят постоянен вкус и качество.

Ключови съображения при мащабиране на ферментацията

1. Дизайн на биореактора

Биореакторът е сърцето на ферментационния процес. Изборът на правилния дизайн на биореактора е от решаващо значение за успешното мащабиране. Ключовите съображения включват:

• Тип на биореактора: Различните типове биореактори са подходящи за различни приложения. Реакторите с разбъркване са най-често срещаният тип, но други опции включват еърлифтни реактори, реактори с барботажна колона и реактори с напълнен слой. Изборът зависи от специфичните изисквания на ферментационния процес, като вида на микроорганизма, нуждата от кислород и чувствителността към напрежение на срязване.
• Система за разбъркване: Системата за разбъркване трябва да осигури адекватно разбъркване за хомогенност, разпределение на хранителни вещества и пренос на кислород. Често срещаните типове бъркалки включват турбини на Ръштън, турбини с наклонени лопатки и морски витла. Броят и конфигурацията на бъркалките, дизайнът на преградите и скоростта на разбъркване трябва да бъдат оптимизирани за конкретния биореактор и ферментационен процес.
• Система за барботиране: Системата за барботиране въвежда въздух или кислород в биореактора. Типът и размерът на барботьора, дебитът на газа и съставът на газа трябва да се контролират внимателно, за да се оптимизира преносът на кислород, без да се причинява прекомерно образуване на пяна или увреждане на клетките.
• Система за топлообмен: Системата за топлообмен трябва да поддържа биореактора при оптимална температура за клетъчен растеж и формиране на продукта. Това обикновено включва съд с кожух с циркулиращ охлаждащ или загряващ флуид. Капацитетът за топлообмен трябва да е достатъчен, за да отведе топлината, генерирана от ферментационния процес.
• Инструментариум и контрол: Биореакторът трябва да бъде оборудван със сензори и контролни системи за наблюдение и регулиране на критични параметри на процеса като температура, pH, разтворен кислород и нива на хранителни вещества. Автоматизираните системи за контрол са от съществено значение за поддържане на постоянна производителност и качество на продукта.

2. Оптимизация на процеса

Оптимизацията на процеса включва идентифициране и оптимизиране на ключовите параметри на процеса, които влияят на клетъчния растеж, формирането на продукта и качеството на продукта. Това обикновено включва комбинация от експериментални проучвания и математическо моделиране.

• Оптимизация на средата: Ферментационната среда трябва да осигури всички хранителни вещества, необходими за клетъчния растеж и формирането на продукта. Оптимизирането на състава на средата може значително да подобри добива и производителността на продукта. Това може да включва вариране на концентрациите на въглеродни източници, азотни източници, витамини и минерали. Статистически експериментални планове, като методологията на повърхностния отговор (RSM), могат да се използват за ефективно оптимизиране на състава на средата.
• Оптимизация на температурата: Оптималната температура за клетъчен растеж и формиране на продукта зависи от конкретния микроорганизъм. Температурата може да повлияе на ензимната активност, флуидността на мембраните и стабилността на протеините. Оптималната температура трябва да се определи експериментално.
• Оптимизация на pH: Оптималният диапазон на pH за клетъчен растеж и формиране на продукта също зависи от конкретния микроорганизъм. pH може да повлияе на ензимната активност, пропускливостта на клетъчната мембрана и разтворимостта на протеините. Прецизният контрол на pH е от съществено значение за оптималната производителност на ферментацията.
• Оптимизация на разтворения кислород: Поддържането на адекватни нива на разтворен кислород е от решаващо значение за аеробните ферментации. Оптималното ниво на разтворен кислород зависи от нуждата на микроорганизма от кислород и капацитета за пренос на кислород на биореактора. Нивата на разтворен кислород могат да се контролират чрез регулиране на скоростта на разбъркване, скоростта на аерация и обогатяването с кислород.
• Стратегии за подаване: При периодични ферментации с подхранване и непрекъснати ферментации скоростта и съставът на подаване трябва да бъдат внимателно оптимизирани, за да се увеличи максимално добивът и производителността на продукта. Стратегии за контрол с обратна връзка могат да се използват за регулиране на скоростта на подаване въз основа на измервания в реално време на концентрацията на глюкоза, pH или разтворен кислород.

3. Мониторинг и контрол

Ефективното наблюдение и контрол на критичните параметри на процеса е от съществено значение за постоянната производителност и качеството на продукта. Това изисква използването на подходящи сензори, контролни системи и техники за анализ на данни.

• Сензори: Налични са различни сензори за наблюдение на критични параметри на процеса, включително температура, pH, разтворен кислород, концентрация на глюкоза, концентрация на биомаса и концентрация на продукт. Изборът на сензор зависи от конкретния параметър, който се измерва, и от изискванията на ферментационния процес.
• Контролни системи: Автоматизираните системи за контрол се използват за регулиране на параметрите на процеса въз основа на обратна връзка от сензори. Често срещаните системи за контрол включват PID (пропорционално-интегрално-диференциални) контролери, които регулират управляваните променливи (напр. температура, pH, скорост на разбъркване), за да поддържат желаните зададени стойности.
• Анализ на данни: Данните, събрани от сензори и контролни системи, могат да бъдат анализирани за идентифициране на тенденции, откриване на аномалии и оптимизиране на производителността на процеса. Техниките за статистически контрол на процесите (SPC) могат да се използват за наблюдение на променливостта на процеса и идентифициране на потенциални проблеми, преди те да повлияят на качеството на продукта.
• Процесна аналитична технология (PAT): PAT е рамка за проектиране, анализиране и контролиране на производствени процеси чрез навременни измервания на критични качествени атрибути (CQAs) и критични параметри на процеса (CPPs). PAT има за цел да подобри разбирането на процеса, да намали променливостта и да подобри качеството на продукта.

4. Осигуряване на стерилност

Поддържането на стерилност е от първостепенно значение при ферментационните процеси. Замърсяването може да доведе до разваляне на продукта, намален добив и дори до пълен провал на процеса. Внедряването на стабилни процедури за стерилизация и асептични техники е от съществено значение.

• Стерилизация на оборудването: Цялото оборудване, което влиза в контакт с ферментационния бульон, включително биореактора, тръбопроводите и сензорите, трябва да бъде старателно стерилизирано преди употреба. Стерилизацията с пара е най-често срещаният метод, но други опции включват автоклавиране, филтрация и химическа стерилизация.
• Стерилизация на средата: Ферментационната среда също трябва да бъде стерилизирана, за да се елиминират всякакви замърсяващи микроорганизми. Това обикновено се прави чрез автоклавиране или филтърна стерилизация.
• Асептични техники: Всички операции, които включват отваряне на биореактора или въвеждане на материали във ферментационния бульон, трябва да се извършват с помощта на асептични техники. Това включва използване на стерилно оборудване, носене на стерилни ръкавици и работа в чиста среда.
• Филтрация на въздуха: Въздухът, влизащ в биореактора, трябва да се филтрира през стерилни филтри, за да се отстранят всички въздушни микроорганизми.
• Затворени системи: Използването на затворени системи минимизира риска от замърсяване. Това включва свързване на цялото оборудване и тръбопроводи в затворен контур и избягване на всякакви отворени трансфери на материали.

5. Контрол на пяната

Образуването на пяна е често срещан проблем при ферментационните процеси, особено тези, включващи протеини или повърхностноактивни вещества. Прекомерната пяна може да доведе до намален пренос на кислород, замърсяване и загуба на продукт. Пяната може да се контролира чрез добавяне на противопенни агенти или използване на механични пеногасители.

• Противопенни агенти: Противопенните агенти са химикали, които намаляват повърхностното напрежение на ферментационния бульон, предотвратявайки образуването на пяна. Често срещаните противопенни агенти включват силикони, растителни масла и мастни киселини. Изборът на противопенен агент зависи от конкретния ферментационен процес и чувствителността на микроорганизма.
• Механични пеногасители: Механичните пеногасители използват въртящи се остриета или други устройства за физическо разчупване на пяната. Те често се използват в комбинация с противопенни агенти.

Стратегии за успешно мащабиране

1. Подход QbD (Качество чрез дизайн)

QbD е систематичен подход към разработката, който започва с предварително определени цели и набляга на разбирането на продукта и процеса, както и на контрола на процеса. Прилагането на принципите на QbD при мащабиране на ферментацията помага да се гарантира постоянно качество и производителност на продукта.

Ключовите елементи на QbD включват:

• Дефиниране на целевия качествен профил на продукта (QTPP): QTPP описва желаните характеристики на крайния продукт, като чистота, активност и стабилност.
• Идентифициране на критични качествени атрибути (CQAs): CQAs са физичните, химичните, биологичните или микробиологичните свойства, които трябва да се контролират, за да се гарантира желаното качество на продукта.
• Идентифициране на критични параметри на процеса (CPPs): CPPs са параметрите на процеса, които могат да повлияят на CQAs.
• Създаване на проектно пространство: Проектното пространство е многоизмерната комбинация и взаимодействие на входни променливи (напр. CPPs) и параметри на процеса, за които е доказано, че осигуряват гаранция за качество. Работата в рамките на проектното пространство гарантира, че продуктът отговаря на желаните качествени атрибути.
• Внедряване на стратегия за контрол: Стратегията за контрол описва как CPPs ще бъдат наблюдавани и контролирани, за да се гарантира, че процесът остава в рамките на проектното пространство и че продуктът отговаря на желаните качествени атрибути.

2. Изчислителна флуидна динамика (CFD)

CFD е мощен инструмент за симулиране на потока на флуиди, топлообмена и масообмена в биореактори. CFD симулациите могат да се използват за оптимизиране на дизайна на биореактора, системите за разбъркване и системите за барботиране. Те могат също така да помогнат за идентифициране на потенциални проблеми като мъртви зони и горещи точки на напрежение на срязване. CFD може да намали броя на скъпите и отнемащи време експерименти в пилотен мащаб, необходими за мащабиране.

3. Модели с намален мащаб

Моделите с намален мащаб са малки биореактори, които са проектирани да имитират условията в голям производствен биореактор. Моделите с намален мащаб могат да се използват за изучаване на ефектите на различни параметри на процеса върху клетъчния растеж, формирането на продукта и качеството на продукта. Те могат също да се използват за отстраняване на проблеми, възникващи по време на мащабиране. Добре характеризираните модели с намален мащаб могат да предоставят ценни прозрения и да ускорят процеса на разработка.

4. Моделиране и симулация на процеси

Моделирането и симулацията на процеси могат да се използват за прогнозиране на поведението на ферментационния процес при различни мащаби и при различни работни условия. Математически модели могат да бъдат разработени въз основа на фундаментални принципи на масообмен, топлообмен и реакционна кинетика. Тези модели могат да се използват за оптимизиране на параметрите на процеса, проектиране на стратегии за контрол и отстраняване на проблеми. Инструменти като MATLAB, gPROMS и Aspen Plus могат да се използват за моделиране и симулация на процеси.

Съображения за последваща обработка

Съображенията за мащабиране се простират отвъд самия ферментационен процес. Последващата обработка, която включва разделяне и пречистване на продукта от ферментационния бульон, също трябва да бъде мащабирана. Изборът на техники за последваща обработка зависи от естеството на продукта, неговата концентрация и желаната чистота. Често срещаните техники за последваща обработка включват:

• Клетъчно разделяне: Отстраняването на клетките от ферментационния бульон често е първата стъпка в последващата обработка. Това може да се направи чрез центрофугиране, филтрация или микрофилтрация.
• Разрушаване на клетките: Ако продуктът е вътреклетъчен, клетките трябва да бъдат разрушени, за да се освободи продуктът. Това може да се направи чрез механични методи (напр. хомогенизация, смилане с перли) или химични методи (напр. ензимна лиза).
• Изолиране на продукта: Продуктът може да бъде изолиран от ферментационния бульон чрез различни техники, включително утаяване, екстракция и адсорбция.
• Пречистване на продукта: Продуктът обикновено се пречиства чрез хроматографски техники, като афинитетна хроматография, йонообменна хроматография и хроматография с изключване по размер.
• Формулиране на продукта: Последният етап в последващата обработка е формулирането на продукта в стабилна и използваема форма. Това може да включва добавяне на ексципиенти, стабилизатори и консерванти.

Глобални примери за успешно мащабиране на ферментация

Няколко индустрии по света разчитат в голяма степен на успешното мащабиране на ферментацията. Ето няколко примера:

• Фармацевтична индустрия (глобално): Производството на антибиотици, ваксини и други биофармацевтични продукти разчита на мащабна ферментация на микроорганизми или клетъчни култури. Компании като Pfizer, Roche и Novartis управляват огромни ферментационни съоръжения по целия свят.
• Хранително-вкусова промишленост (Европа, Северна Америка, Азия): Производството на бира, вино, кисело мляко, сирене и други ферментирали храни и напитки разчита на контролирани ферментационни процеси. Компании като Anheuser-Busch InBev (Белгия), Danone (Франция) и Kirin Brewery (Япония) са усъвършенствали мащабирането на ферментацията в продължение на много години.
• Индустрия за биогорива (Бразилия, САЩ): Производството на етанол от захарна тръстика (Бразилия) и царевица (САЩ) включва мащабна ферментация на захари от дрожди. Компании като Raizen (Бразилия) и Archer Daniels Midland (САЩ) управляват мащабни съоръжения за производство на биогорива.
• Индустриална биотехнология (Дания, Германия, Китай): Производството на ензими, биопластмаси и други продукти на био основа разчита на ферментация на генетично модифицирани микроорганизми. Компании като Novozymes (Дания), BASF (Германия) и Amyris (САЩ) са лидери в тази област.

Отстраняване на често срещани проблеми при мащабиране

Въпреки внимателното планиране и изпълнение, по време на мащабирането на ферментацията все още могат да възникнат проблеми. Ето някои често срещани проблеми и потенциални решения:

• Намален добив на продукт: Това може да се дължи на промени в метаболитните пътища, ограничения на хранителни вещества или натрупване на инхибиторни странични продукти. Прегледайте състава на средата, оптимизирайте стратегиите за подаване и осигурете адекватен пренос на кислород.
• Повишен риск от замърсяване: Това може да се дължи на неадекватни процедури за стерилизация или нарушения в асептичната техника. Прегледайте протоколите за стерилизация, подобрете филтрацията на въздуха и въведете по-строги асептични процедури.
• Свръхпроизводство на пяна: Това може да се дължи на промени в състава на средата или физиологията на клетките. Оптимизирайте добавянето на противопенен агент или инсталирайте механичен пеногасител.
• Промени в клетъчната морфология: Това може да се дължи на промени в напрежението на срязване или градиентите на хранителни вещества. Оптимизирайте дизайна на бъркалките, скоростта на разбъркване и стратегиите за подаване.
• Нестабилност на продукта: Това може да се дължи на промени в pH, температурата или наличието на разграждащи ензими. Оптимизирайте параметрите на процеса и добавете стабилизатори към средата.

Бъдещи тенденции в мащабирането на ферментацията

Областта на ферментацията непрекъснато се развива. Някои от ключовите тенденции, които оформят бъдещето на мащабирането на ферментацията, включват:

• Непрекъсната ферментация: Непрекъснатата ферментация предлага няколко предимства пред периодичната ферментация, включително по-висока производителност, по-ниски експлоатационни разходи и по-постоянно качество на продукта.
• Биореактори за еднократна употреба: Биореакторите за еднократна употреба елиминират необходимостта от почистване и стерилизация, намалявайки риска от замърсяване и опростявайки операциите.
• Усъвършенстван контрол на процесите: Усъвършенствани техники за контрол на процесите, като моделно предиктивно управление (MPC) и машинно обучение, се използват за оптимизиране на ферментационните процеси в реално време.
• Синтетична биология: Синтетичната биология се използва за инженеринг на микроорганизми с подобрени метаболитни възможности и производителност.
• Микробни общности: Използването на микробни общности и консорциуми може да отключи нови метаболитни пътища и да подобри ефективността на биопроцесите.

Заключение

Мащабирането на търговски ферментационни процеси е сложна, но съществена стъпка за пускането на биопродукти на пазара. Чрез внимателно обмисляне на ключовите фактори, обсъдени в това ръководство, включително дизайн на биореактора, оптимизация на процеса, мониторинг и контрол, осигуряване на стерилност и контрол на пяната, компаниите могат успешно да мащабират своите ферментационни процеси и да постигнат постоянно качество и производителност на продукта. Възприемането на нови технологии и методологии, като QbD, CFD, модели с намален мащаб и усъвършенстван контрол на процесите, ще подобри допълнително ефективността и стабилността на търговските ферментационни операции в световен мащаб.